mRNA-LNP：助力下一代CAR-T 细胞疗法

基因编辑技术的发展为科研人员提供了直接靶向和修改活体生物基因序列的方法。该技术通过创建更精确的细胞和动物模型，扩展了我们对人类疾病背后遗传学的理解。从基础研究到应用生物技术和生物医学研究的各个领域，该技术都极具潜力¹。然而一直以来，将基因编辑工具递送到靶细胞都是一项极具挑战的工作。如果有一种安全高效的基因递送新技术不受内载基因的限制，研究人员将能够实现基因编辑策略的全部潜力，从而探索癌症治疗的新途径。

基因编辑的基础依赖于在感兴趣的染色体位点启动双链断裂 (DSB)，以触发两种内源性细胞 DNA 修复途径之一：非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR)，它们分别导致基因破坏或靶向整合。一直到 2013 年之前，工程核酸酶，如锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 是用于基因编辑的主导技术。然而，漫长的开发时间加上相对较低的编辑效率，限制了该领域的发展速度。

2013 年，来自细菌适应性免疫防御系统的成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/Cas 相关核酸酶的发现给基因编辑领域带来了颠覆性改变。CRISPR/Cas9 系统使用短链向导 RNA (sgRNA) 来引导 Cas9 介导的切割和供体 HDR 模板的插入。相比 ZFN 和 TALEN，重新定位Cas9的RNA设计具有简单、应用广泛、易调整等显著优势，从而开创了基因工程的新时代。随着基因编辑领域继续创新和快速发展，业界正在研究替代性或工程化的 CRISPR 核酸酶（即 Cas12 和 dead Cas9）和其他模式，如碱基和引物编辑，以提高效率并减少脱靶效应。

T 细胞的基因工程催生了新的癌症免疫疗法，如嵌合抗原受体 (CAR)-T 细胞疗法，彻底颠覆了癌症治疗方法。目前的自体 CAR-T 免疫疗法已展现较高的临床成功率，但该疗法的安全性和有效性仍有待提高。下一代 CAR-T 免疫疗法的重点是增强 CAR-T 细胞的效力，限制脱靶效应，将治疗目标扩展至液体癌以外的癌症，并从同种异体供体中制造通用 CAR-T 细胞¹。这些新策略需要更复杂的、基于CRISPR/Cas9的基因工程策略，其中所选的基因递送方法决定着基因编辑的效率、安全性和可扩展性。

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基因编辑工具的递送机制

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基于 T 细胞基因编辑的疗法可分为体内和离体疗法（图 1）。在体内疗法中，基因编辑机器被直接输入体内。另一方面，在离体疗法中，靶细胞被分离、基因工程改造并重新输回患者体内。虽然病毒载体已在临床上高效地用于 T 细胞工程，但是该方法存在几个缺点，例如成本较高、具有潜在的插入突变风险和脱靶效应，这给患者带来了安全隐患²。就其安全性、简单性和灵活性而言，非病毒递送模式已成为病毒载体的优质替代方案。

图 1. 体内和离体基因编辑的示意图。对于体内基因编辑，基因编辑机器直接输入体内。对于离体基因编辑，分离靶细胞后，进行基因改造，再重新输回患者体内。

被长期用于离体递送的非病毒方法之一就是电穿孔。这种技术利用脉冲高压电流瞬时打开细胞膜中的纳米级通道，将核酸递送到细胞中。对于 CRISPR/Cas9，需要连续的电脉冲来分别递送 Cas9 mRNA 和 sgRNA。这导致需要在效率和细胞存活率之间做出巨大的权衡取舍，使得用电穿孔方法进行一系列或多重基因操作十分困难。

脂质纳米粒 (LNP) 则不需要这样的权衡，这使其成为相比电穿孔更加有效的 RNA 递送替代方法。LNP 是完全合成的脂质制剂，用于在将 RNA 递送到靶细胞之前包封和保护 RNA 免受核酸酶降解。RNA-LNP 复合物在结构上与低密度脂蛋白 (LDL) 类似，可以利用 LDL 的内源性摄取途径，通过受体介导的内吞作用进入靶细胞。这种温和的摄取机制能够成功和高效地进行 T 细胞基因工程，与电穿孔方法相比具有一致的高水平基因表达、高转染效率和高活细胞产量。事实上，临床阶段基因编辑技术领先的企业 Intellia Therapeutics 发布的数据显示，在他们的同种异体 TCR-T 和 CAR-T 项目中，LNP 有效地取代了电穿孔向 T 细胞递送 CRISPR/Cas9 基因编辑物。LNP 避免了多重编辑带来的染色体易位风险，以及电穿孔对 T 细胞活性的负面影响。

Precision NanoSystems 利用其对 LNP 化学和细胞生物学的深厚知识，设计了一款专用于T细胞基因编辑的LNP 组合物。因为 LNP 特性对生产条件敏感，所以需要对生产过程进行精确且可重复的控制，以确保颗粒生产的一致性。

NanoAssemblr 仪器与GenVoy-ILM^™ T Cell Kit for mRNA（可用于 NanoAssemblr Spark^™ 和 Ignite^™ 仪器）等专用试剂盒配套使用，为研究人员提供所需的工具，帮助他们再自己的实验室内建立可靠、可扩展的离体基因递送方法。mRNA-LNP 可以轻松无缝地整合到标准的原代 T 细胞培养工作流程中，以促进从概念到临床实践的下一代 CAR-T 细胞疗法的生产。

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LNP助力下一代基因编辑

CAR-T 细胞疗法

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多个概念验证实验强调了使用 GenVoy-ILM T Cell Kit for mRNA制备的LNP，在进行自体和异体 CAR-T 细胞治疗开发时的有效性和通用性（图 2）³。

图 2. LNP 易于整合到离体 CAR-T 细胞基因工程策略中，包括基因表达 (a)、单基因敲除 (b)、双基因敲除 (c) 和多步骤基因敲除和表达 (d)。

自体细胞疗法

在通过 LNP 和电穿孔两种方法将抗CD19 CAR mRNA 递送至 T 细胞的对比实验中，发现LNP方法的转染效率 (TE) 显著高于电穿孔。并且观察到更高的细胞存活率和同质程度更高的 CAR 表达，这是对 CAR-T 产品的最终细胞产量产生积极影响的重要参数³。研究还表明，与电穿孔和/或慢病毒转染相比，LNP 介导的 CD19 CAR-T 细胞表现出同等的肿瘤杀伤能力^4,5。

同种异体细胞疗法

从健康供体细胞产生的同种异体 CAR-T 细胞产物有潜力克服与自体疗法相关的、已论证的缺点，但必须解决宿主同种异体排斥和移植物抗宿主病 (GVHD) 风险等挑战。使用 LNP 作为递送载体的 CRISPR/Cas9 基因编辑 支持天然 αβ TCR 的单基因敲除 (KO) 以及 TCR 和 T 细胞标志物 CD52 的双基因敲除，以允许抗体介导性（抗 CD52）淋巴细胞清除。T 细胞标志物 CD52 的敲除，允许对患者（抗 CD52）进行抗体治疗以增强淋巴细胞清除，同时不影响输入的同种异体 CAR T 细胞，以降低同种异体反应性和 GVHD。此外，使用LNP介导的CRISPR/Cas9进行基因KO的多步骤工程，再进行CAR转基因表达，成功产生了功能性强的 TCR–CD19 CAR-T 细胞，证明其在体外可以有效杀伤肿瘤细胞³。

在各种基因改造场景中，LNP 介导的基因递送表现出的简易性为研究人员提供了相较于病毒载体和电穿孔的显著优势，以加速下一代 CAR-T 细胞疗法的发展。

结束语

基因递送平台需要支持多种多样的基因策略来开发新的基因药物。随着该领域将重点转向解决新的疾病靶点，并致力于同种异体方法以开发“现成”的产品来服务更多的患者群体，需要多重或顺序基因操作的工作流程变得越来越普遍。LNP 正在多个基因编辑项目中用于临床评估。Intellia Therapeutics 公司正在临床管线中加速推进基于LNP CRISPR系统的体内和离体产品。OTQ923/HIX763 专注于造血干细胞的离体基因编辑以治疗镰状细胞疾病，而公司领先的、用于治疗甲状腺素运载蛋白 (ATTR) 淀粉样变性的体内基因编辑候选物NTLA-2001，已报道初步临床结果颇具前景。

病毒载体和电穿孔有诸多缺点，例如内载基因长度受限、细胞活性低和转染效率欠佳。LNP 是一种经过临床验证的可扩展技术，已用于制备FDA 批准的COVID-19 mRNA 疫苗，和第一种基于小干扰 RNA 的药物 ONPATTRO^® (patisiran)。这种递送技术已被证明在基因递送和编辑应用上，具有有效性、温和性和可扩展性，有助于在快速发展的临床环境中加速 T 细胞疗法研究和药物开发。

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参考文献

1) Li H, Yang Y, Hong W, Huang M, Wu M, Zhao X. Applications of genome editing technology in the targeted therapy of human diseases: mechanisms, advances and prospects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):1. Published 2020 Jan 3. doi:10.1038/s41392-019-0089-y

2) Xu X, Wan T, Xin H, et al. Delivery of CRISPR/Cas9 for therapeutic genome editing. J Gene Med. 2019;21(7):e3107. doi:10.1002/jgm.3107

3) Precision Nanosystems. Genome Editing of Human Primary T Cells with Lipid Nanoparticles. Application Note: CRISPR-AN-0322

4) Billingsley MM, Hamilton AG, Mai D, et al. Orthogonal Design of Experiments for Optimization of Lipid Nanoparticles for mRNA Engineering of CAR T Cells. Nano Lett. 2022;22(1):533-542. doi:10.1021/acs.nanolett.1c02503

5) Billingsley MM, Singh N, Ravikumar P, Zhang R, June CH, Mitchell MJ. Ionizable Lipid Nanoparticle-Mediated mRNA Delivery for Human CAR T Cell Engineering. Nano Lett. 2020;20(3):1578-1589. doi:10.1021/acs.nanolett.9b04246

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