合成生物学前沿 | 碱基编辑“传感器”文库将单碱基突变置于聚光灯下
合成生物学是生物学工程化高度交叉的前沿学科研究领域，包含几个不同的研究层次：认识生命、改造生命和创造生命；要想实现其终极目标，还需要在生命本质探索及相关技术的不断创新与应用上持续深入。基因编辑技术是合成生物学领域的一类重要工具，能够实现基因组的定向修改，如插入、删除、修改、替换。
本期内容聚焦一项发表在 Nature Biotechnology 上的基因编辑创新研究，来自于美国麻省理工科赫综合癌症研究所的肿瘤生物学家 Francisco J. Sánchez-Rivera，题目为“Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants”[1]。该研究通过构建一个可以测量碱基编辑器工作效率及精度的“传感器”文库工具，并提供相应的线上应用软件 BE-SCAN，助力其他研究者更加容易地设计基于碱基编辑器的分子元件，加速实现研究目的。本文中的“传感器”文库是由安捷伦 SurePrint 高保真寡核苷酸文库合成平台提供的。
该研究的亮点包括：
1
独创性设计了碱基编辑“传感器”，为单碱基变异的高通量筛选和功能研究提供有力工具；
2
通过检测 20 万种“碱基编辑器 -sgRNA- 细胞类型”组合，为“传感器”工具积累了充分数据；
3
利用体外细胞和体内动物实验，验证“传感器”在构建单碱基突变体和高通量功能筛选上的有效性，并且发现之前未被研究报道过的重要 TP53 突变位点；
4
搭建了灵活的生信方法 AMINEsearch 和线上软件 BE-SCAN，可以帮助更多研究者进行单碱基突变研究。
碱基编辑器和
碱基编辑“传感器“工具
CRISPR/Cas9 介导的经典基因编辑技术[2]，通过 Cas9 蛋白在 DNA 靶标形成双链断裂（DSB），利用体内的修复机制，产生定向插入、删除等随机修饰，但很难实现精准的单碱基替换。然而，单碱基变异可以导致很多已知疾病的发生，与日俱增的基因组测序研究也在积累大量意义不确定的点突变，因此碱基编辑器（BE）技术应运而生 [3]。与经典的 CRISPR-Cas9 系统相比，BE 技术主要对Cas9蛋白模块做了修改，一方面将 Cas9 蛋白切割产生双链断裂功能失活，另一方面在失活的 Cas 蛋白上融合脱氨酶模块，从而实现单碱基的替换，如将某位点的 C 转换成 T 的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）。
本文就是在 CBE 的基础上，构建了碱基编辑器“传感器”工具，用来检测多种 CBE 系统的编辑效率和精准度。如图 1 所示，在慢病毒载体上，将 sgRNA 序列与对应的同源目标序列顺式连接，形成“传感器”序列。将装载不同“传感器”序列的载体转染到可以表达碱基编辑酶组分的细胞系后，可以实现高通量碱基编辑。通过进一步对“传感器”编码区域进行 PCR 扩增和高通量测序，就可以测量每个具体的“编辑器 +sgRNA+ 靶标序列”的碱基编辑效率。
图 1. 碱基编辑“传感器”示意图
构建基于真实世界临床肿瘤数据的
碱基编辑“传感器”文库
如图 2 所示，为了使碱基编辑“传感器”的元件设计更加简便，作者团队搭建了一款设计算法 AMINEsearch。接下来，作者从肿瘤大 panel 检测项目 MSK-IMPACT 的分析数据中提取了部分突变数据集，通过 AMINEsearch 软件，设计出人的肿瘤传感器文库（HBES），共包括 5855 个 sgRNAs 序列、靶向 1450 个点突变。通过将 HBES 比对到小鼠的同源序列位点，设计出针对小鼠的肿瘤传感器文库（MBES），共包括 4686 个 sgRNAs 序列、靶向 1177 个点突变。
图 2. 碱基编辑“传感器”算法和线上应用示意图
值得一提的是，在初步构建两个文库时，作者发现有将近一半的文库序列发生了错误。在反复试错和优化后，最终通过与安捷伦合作，使用 SurePrint 高保真 OLS 平台，才得以合成低错误率的“传感器”序列。如作者所言，“这真的是我们可以合成传感器结构的唯一方式”。
图 3. 文章的方法部分，使用安捷伦 SurePrint 高保真寡核苷酸文库合成平台构建“传感器”序列
在后续的文库筛选中，HBES 和 MBES 被分别转染到可以表达碱基编辑系统的细胞系 MDA-MB-231 中，共测试了三种碱基编辑系统。结果分析发现，PAM 模式、目标胞嘧啶位置和双核苷酸序列背景对碱基编辑效率有显著影响。为了进一步探索不同细胞系的表现，作者又纳入 4 种额外的细胞系，并发现虽然不同细胞系的编辑效率不一，但在 PAM 偏好性、编辑窗口容许范围和单一 sgRNA 序列编辑效率上是高度一致的。至此，本研究共检测 20 万种“碱基编辑器 -sgRNA- 细胞类型”的组合，为“传感器”工具积累了充分数据。除了关注目标位点 C-T 转化结果，作者还对非靶标 C-T 转化和非经典的 C-G 颠换进行分析，因篇幅限制不再赘述。
验证三连击
内源目标编辑验证+
小规模功能验证+高通量功能挖掘
内源目标编辑验证：
在利用“传感器”工具在细胞内引入碱基编辑时，此效应会同时作用在传感器同源序列和细胞的内源序列。为了检测两种效应间的一致性，作者进行了 13 个 sgRNA 的小规模测试。结果表明（图 4），在 50% 的情况下，内源编辑效率与“传感器”数据的差距在 10% 以内，显示了“传感器”对内源目标编辑效率预测的有效性。
图 4. 内源目标基因编辑效率验证（vs“编辑器”预测数据）
小规模功能验证：
TP53 是常见的肿瘤抑制基因，在肿瘤组织中发生突变的频率高，且有较高的突变异质性 [4]，故作为小规模功能验证的靶标基因。在小鼠文库（MBES）的候选者中，挑选了 5 条编辑效率较高、不容易引起额外突变的 sgRNA 序列进行后续验证实验。在小鼠胰腺癌模型细胞系生长实验中，相比于对照细胞，引入碱基编辑的细胞系在 Nutlin-3（一种促进 TP53 抑癌效应的物质）添加的环境中生长情况更好，显示了 TP53 功能在一定程度上得到了抑制。如图 5，进一步在小鼠中的体内实验结果显示，移植了被碱基编辑的细胞系的小鼠，在 100 天内均因胰腺肿瘤死亡。对肿瘤组织进行分析，发现目标位点发生了大量的 C-T 突变。
图 5. 小规模功能验证结果
高通量功能挖掘：
因为“传感器”工具可以同时编辑传感器序列和内源序列，因此内源序列突变导致的细胞表型变化可以与传感器序列编辑效率相关联，并且理论上也可以发掘已经发生单碱基突变但未导致显著表型效应的位点。如图 6 所示，将小鼠文库（MBES）进行小鼠胰腺癌模型细胞系转染，通过体外细胞增殖筛选，发掘到 150 个对增殖生长有显著效应（促进或者抑制）的 sgRNA。其中有促进生长作用的 sgRNA 靶向不少与致癌（如 Jak3、Fgfr2）或抑癌（如 Trp53、Apc）有关的基因。在这些候选 sgRNA 中，进一步对靶向 Trp53 位点进行功能挖掘，找到一系列在体内和/或体外编辑效率较高的位点，其中点突变位点 T211I（小鼠中对应位点是 T208I）被认定为胰腺癌小鼠模型中的驱动突变。
图 6. 高能量功能挖掘流程示意图
结 语
碱基“传感器”的线上软件工具 BE-SCAN 已经开发，网站地址是 https://dowlab.shinyapps.io/BEscan/，可以为其他研究者提供验证数据参考和元件设计支持。
未来，Sánchez-Rivera 博士团队将把“传感器”工具拓展到“先导编辑”技术中，进一步扩大该工具的基因编辑应用范围。
安捷伦 SurePrint 寡核苷酸合成平台将继续为广大研究者提供最高质量的底层工具，助力科学创新更进一步！
图 7. SurePrint DNA 寡核苷酸合成技术示意图
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CRISPR 基因编辑原理与应用
参考文献：
[1] Sánchez-Rivera, F.J., Diaz, B.J., Kastenhuber, E.R. et al. Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants. Nat Biotechnol 40, 862–873 (2022).
[2] Martin Jinek et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.Science337,816-821(2012).
[3] Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).
[4] Kastenhuber, E. R. & Lowe, S. W. Putting p53 in context. Cell 170, 1062–1078 (2017).
E.N.D