Science, Nature, Cell发布神器—冷冻电镜到底是何方神圣？

背景

结构生物学是诞生于上个世纪中叶通过研究生物大分子的结构与运动来阐明生命现象的学科。在过去半个世纪里，X射线法解析生物大分子结构一直占据结构生物学的统治地位。而近年来，冷冻电镜在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了突飞猛进的发展。该技术它可以快速、简易、高效、高分辨率解析高度复杂的超大生物分子结构，在很大程度上取代并且大大超越了传统的X射线晶体学方法。

X射线衍射法（上）和冷冻电镜法（下）图片来源：Ewen Callaway: The revolutionwill not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.

冷冻电镜原理

冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包括样品制备、电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤。

冷冻电镜解析结构步骤  图片来源：中科院计算所

透射电子显微镜成像过程中，电子束穿透样品，将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。1968年，Aron Klug发现中心截面定理，提出可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。根据这一原理，利用透射电子显微镜获得生物样品多个角度的放大电子显微图像，即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。

三维重构原理图，图片来源：尹长城. 冷冻电镜在生物医学中的应用. 北京大学蛋白质科学中心课件

冷冻电镜制样

FEI vitrobot 冷冻制样机

常规的冷冻方式冷却速度缓慢，冷却过程中，蛋白质水溶液会因结晶而变形扭曲，造成生物分子的结构的破坏。快速冷冻制样是将样品快速放入液氮冷却的液态乙烷中，由于冷却速度快，使得水分子还来不及结晶就被固定住，整个冷冻过程在数毫秒之内就完成了（冷冻速率>104℃/s），冷冻好的水以玻璃态存在，不存在晶体结构，能使蛋白质结构保持其天然结构状态。

样品在液氮中冷冻

冷冻制样是目前结构生物学领域最好的样品制样方法，相对于传统的制样，其特点主要有：

• 高速冷冻过的玻璃态水中，样品水合状态得以保存，结构不受破坏；

• 可获得高分辨率的结构数据，分别率可达0.2nm；

• 可降低样品的辐射损伤；

• 样品准备较复杂；

• 衬度较差。

蛋白质颗粒随机分布在玻璃态水中  图片来源：Martin T. J. Smith, John L. Rubinstein. Beyond blob-ology [J].Science, 2014, 345 617-619.

冷冻电镜成像

冷冻的样品冷冻输送器转移到电镜的样品室，在电镜成像之前，需确认样品中的水处于玻璃态。由于生物样品对高能电子的辐射敏感，成像时必须使用低剂量技术（<20e/ Å2）。低剂量技术要点：

• 寻找观察区域要在低倍下进行（1-3K）；

• 聚焦在拍照区域的相邻区域进行（100-300K）；

• 记录区域仅在拍照时受到辐射（30-60K）；

Titan Krios系统整体结构（左）和内部结构（右）

经过透射电子显微镜中一系列复杂的过程，最终在记录介质上会形成样品放大几千倍至几十万倍的图像。近年来，基于互补金属氧化物半导体（CMOS）技术开发的直接探测电子成像的装置使电子显微放大图像的信噪比相对过去所使用的底片或电荷耦合元件（CCD）有了很大提高，进而提高了成像的质量。

冷冻电镜结构解析

电子晶体学（Electron Crystallography）

电子晶体学技术利用电子显微镜的成像和电子衍射的功能，从生物大分子的二维晶体获取结构信息，解析其三维结构。其适合的样品分子量范围为10~500kD，最高分辨率约1.9Å。该方法与X射线晶体学的类似之处在于均需获得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之处是利用电子显微镜除了可以获得晶体的电子衍射外还可以通过获得晶体的图像来进行结构解析。

电子晶体学法确定膜蛋白结构 图片来源：Jacqueline L. S. Milne, MarioJ. Borgnia, Alberto Bartesaghi et al. Cryo-electron microscopy-a primer for thenon-microscopist [J]. FEBS Journal, 2013, 280: 28-45.

单颗粒技术（Single-ParticleEM）

单粒子法不需要样品具备晶体结构，这大大拓宽了其研究领域，使生物大分子及其复合体的构象研究成为可能。其适合的样品分子量范围为80~50MD，最高分辨率约3Å。单颗粒技术近年来发展迅速，已成为主流的重构技术，不断有文章报道利用此技术所获得的大分子复合物的三维结构。单颗粒技术的一般步骤为：

• 玻璃态样品的准备；

• 粒子的采集；

• 粒子参量的确定与分类；

• 3D重构；

• 粒子参量的优化；

• 提高分辨率；

• 分辨率评估和结构解析。

单颗粒技术重构GroEL蛋白 图片来源：Jacqueline L. S. Milne, Mario J. Borgnia, Alberto Bartesaghi et al.Cryo-electron microscopy-a primer for the non-microscopist [J]. FEBS Journal,2013, 280: 28-45.

断层扫描成像技术（Cryo-Electron Tomography）

断层扫描成像技术重构波形蛋白 图片来源：Lars Norléna, Sergej Masicha, KennethN. Goldie, et al. Structural Analysis of Vimentin and Keratin Intermediate Filamentsby Cryo-electron Tomography [J]. EXPERIMENTAL CELL RESEARCH, 2007, 313:2217-2227.

通过在显微镜内倾转样品从而收集样品多角度的电子显微图像并对这些电子显微图像根据倾转几何关系进行重构的方法称为电子断层扫描成像技术。该方法主要应用于细胞及亚细胞器，以及没有固定结构的生物大分子复合物（分子量范围为800kD），最高分辨率约20Å。其在研究非定形、不对称和不具全同性的生物样品的三维结构和功能中有着不可替代的作用。

冷冻电镜技术发展历程

发展历程

冷冻电镜技术主要发展历程 数据来源：Eva Nogales. The development ofcryo-EM into a mainstream structural biology technique [J].

技术革新

过去30年来制约冷冻成像应用的瓶颈主要是冷冻成像和图像处理算法。直到近年，两大革命性的技术突破，使冷冻电镜的应用推到了前所未有的高度，两大技术突破分别是：一是直接电子探测器的发明，二是高分辨图像处理算法的改进。前者从硬件上让电镜的图片质量和信噪比有了质的提升，将冷冻电镜带入了一个以电影的形式快速记录电镜图像的新时代，后者则从软件上将冷冻电镜分辨率推入到了一个全新的高度，甚至让高度柔性动态的样品的高分辨解析变得可能。

分辨率对观测结果的影响（左）不同分辨率对应能测定的分子结构（右）图片来源：Elad Binshtein, Melanie D. Ohi Cryo-Electron Microscopy and theAmazing Race to Atomic Resolution [J]. Biochemistry, 2015, 54: 3133-3141. &尹长城.冷冻电镜在生物医学中的应用. 北京大学蛋白质科学中心课件

与传统的电荷耦合器件相比，最新的技术能够直接把电子抓下来，甚至可以对单个电子进行局部定位，大幅提高电子探测效率。与此同时，高效探测器可以把曝光分解成多次并且保证总电子量不变，将照片变成了拍电影再把这些电影合并成一张近乎于完美的照片，避免了电子束击打生物样品造成的图像漂移和辐射损伤。由于篇幅限制，关于冷冻电镜的技术革新，本文不再多介绍，有兴趣的朋友可以查看Yifan Cheng在Cell发表的论文：Single-ParticleCryo-EM at Crystallographic Resolution.

中国冷冻电镜的现状

我国科学家在90年代开始冷冻电镜技术的研究，起步比较晚，经过各方面的努力，当前我国的冷冻电镜研究已经取得了一定的成绩，与国际先进水平的差距逐渐缩小。2008年国内当时只有一两个课题组从事冷冻电镜应用研究，而到今年粗略估计已有近20个课题组。清华大学、北京大学、生物物理所、北京生命科学研究所、计算技术研究所、国家蛋白质科学中心、中科大、浙大、上海科技大学、湖南师范大学等都有老师在做这方面的研究，下图是国内冷冻电镜主要研究人员分布。

中国冷冻电镜主要研究人员分布 数据来源：Hong-Wei Wang, Jianlin Lei,Yigong Shi. Biological cryo-electron microscopy in China [J]. ROTEIN SCIENCE,2017, 26: 16-31.

以下是近年来中国冷冻电镜主要研究成果：

近年中国在冷冻电镜领域的主要成果 数据来源：Hong-Wei Wang, Jianlin Lei,Yigong Shi. Biological cryo-electron microscopy in China [J]. ROTEIN SCIENCE,2017, 26: 16-31.

参考资料：

Elad Binshtein, Melanie D. OhiCryo-Electron Microscopy and the Amazing Race to Atomic Resolution [J].Biochemistry, 2015, 54: 3133-3141.

Jacqueline L. S. Milne, Mario J. Borgnia,Alberto Bartesaghi et al. Cryo-electron microscopy-a primer for thenon-microscopist [J]. FEBS Journal, 2013, 280: 28-45.

Hong-Wei Wang, Jianlin Lei, Yigong Shi.Biological cryo-electron microscopy in China [J]. ROTEIN SCIENCE, 2017, 26:16-31.

Ewen Callaway: The revolution will not becrystallized: a new method sweeps through structural biology.

Yi fan Cheng. Single-Particle Cryo-EM atCrystallographic Resolution [J]. Cell, 2015, 161: 450-457.

Eva Nogales. The development of cryo-EMinto a mainstream structural biology technique [J].

Martin T. J. Smith, John L. Rubinstein.Beyond blob-ology [J]. Science, 2014, 345 617-619.

知乎专栏：什么是2015年最受科学界关注的新技术？

尹长城. 冷冻电镜在生物医学中的应用. 北京大学蛋白质科学中心课件

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