【文献解读】SciRep: Nanopore宏基因组组装方法对比

                简介                 

标题：Assembly methods for nanopore-based metagenomic sequencing: a comparative study

杂志：Scientific reports影响因子：3.998发表时间：2020年4月12日解读：章小鱼编辑：很跩的土豆

导读：宏基因组测序可以还原尚未探究的微生物基因组，短读长测序平台会导致序列高度片段化，而基于Nanopore的长度长测序技术可组装出更多连续性序列。然而，目前尚无研究来系统评估不同组装工具对纳米孔数据的组装效果。在这项研究中，作者使用不同组装工具组装两个商用mock community基因组。在测试工具中，只有metaFlye、Raven和Canu在所有数据集中表现良好，能直接从宏基因组学数据中组装出高度连续甚至完整的基因组。值得注意的是，尽管Nanopore测序存在一定的碱基误判，但是组装后的一致序列准确性可高达99.5到99.8%。Polishing能够减少插入缺失的数量，这一步骤对生物合成基因簇的预测有较大影响。使用高质量短读长序列校正并非总是获得高质量的组装序列。总体而言，Nanopore MinION测序产生的宏基因组测序足以组装和表征低复杂度微生物群落。

                正文                 

1．ZymoBIOMICS mock community种类及其理论组成

表1. ZymoBIOMICS mock community种类及其理论组成

2. 数据集

表2. 原始数据和亚组数据的测序信息

3. 宏基因组拼装

图1. 评估每个测试工具相对应的宏基因组组装片段大小。（A）相对于参考宏基因组大小的组装图大小；（B）通过metaQUAST和minimap2 + BBTools计算的组装基因组草图相对参考宏基因组的覆盖度（%）。

图2. 使用每种工具以及每种单独的微生物（样本数据集）获得的组装图覆盖的基因组的比例。Miniasm组装图因无法使用metaQUAST评估而未显示。

图3. 每个工具针对样本数据集的通用组装性能指标。（A）运行时间；（B）N50；（C）Contigs的数目；（D）L50。

Note：N50 describes a sequence length whereas L50 describes a number of sequences.

图4. 使用Even GridION（14 Gbp）数据集评估组装性能最佳的工具。（A）组装草图在参考基因组中的覆盖度；（B）每种微生物的Contigs数量。

4. 拼装准确性

图5. 组装草图的准确性（样本数据集）。（A）相似性百分比（利用对应宏基因组大小进行标准化）；（B）插入缺失百分比（利用对应宏基因组大小进行标准化）。这两种情况都使用了两种不同的策略：top panel，用minimap 比对并使用bcftools +'indels_and_snps.py'内部脚本进行评估；bottom panel，用MuMMer比对，并使用Goldstein等人的“ count_SNPS_indels.pl”脚本进行评估。

5. 生物合成基因簇预测

图6. 使用antiSMASH预测Even GridION数据集中每个组装草图的生物合成基因簇（BGC）的数量。（A）使用3 Gbp数据集预测的BGC；（B）使用6 Gbp数据集预测的BGC

6. Polishing评估

图7. Polising评估。（A）Polishing对整个基因组分析改善效果（%），以Polishing前的错误数量为参考；（B）每个工具达到的最高相似百分比；（C）每种工具获得的最佳插入缺失率。注意，根据工具的不同，可能需要不同数量的polishing次数以实现最高的相似性和最低的插入/缺失比。

结论

基于短序列的Shortgun宏基因组测序通常会导致基因高度片段化，从而使下游分析变得复杂。该研究表明，Nanopore数据可以克服三代测序平台碱基判读错误率高的缺点，并能够直接从简单的微生物群落中遍历极其连续的基因组。但是，根据所选软件的不同，组装性能会有很大差异。其中metaFlye是最适合Nanopore宏基因组数据的组装软件，该工具可实现最高的宏基因组恢复率和强大的运行性能。Raven的主要特点是省时。Canu在要求较低错误率时更适用，但其组装草图需进行polishing以减少插入缺失的数量。使用短读长序列进行polishing并不一定会提高组装草图的质量，但与Canu结合使用，可以对基因组进行最准确的重建。总的来说，这项研究证明了单独使用Nanopore测序来组装低复杂度微生物群落的适用性，并为长片段测序数据的生物信息流程的标准化开辟了道路。

                参考                 

[1] Scientific Reports (2020) 10:13588. DOI: 10.1038/s41598-020-70491-3

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【往期文献】

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