应用全二维液相色谱质谱联用技术（HILIC×RP-LC-UV-MS）分析红酒中的花青素及其衍生色素
花青素类化合物会随着红酒放置时间的延长而变化，这些化合物具有结构多样性、含量低和质谱特征相似等特点，多维色谱分离在分析复杂成分的过程中变得极为重要。因此，作者等人建立了一种亲水作用色谱（HILIC）和反相液相色谱（RP-LC）相结合的全二维液相色谱质谱分析方法来研究红酒中的花青素及其衍生化合物。其中第一维采用的是微流系统（capillary liquid chromatography system），第二维采用超高效液相色谱系统（ultrahigh-pressure LC system）。最终在放置一年和六年的红酒中鉴定了94种花青素衍生色素。
样品处理：采用6mL甲醇0.1%甲酸）和6mL水（0.1%甲酸）活化SPE柱，将100mL红酒样品上样，再用10mL的酸性水淋洗2次，最后用5mL甲醇/甲酸（95/5）溶剂洗脱，浓缩挥干后用0.5mL相同溶剂复溶，待测。
色谱质谱条件：第一维色谱柱使用AcquityUPLC BEH Amide column (150 × 1 mm i.d., 1.7 μm)，流速为1.0 μL/min；第二维色谱柱使用Phenomenex Kinetex C18 column (50 × 2.1 mm i.d., 1.3μm)，流速为860 μL/min。一级和多级质谱数据采集使用QTOF质谱，正离子模式，碰撞电压为20-60V。
图1 不同第一维流速下（1,2,6,10μL/min），分流比、第二维分析时间和峰容量的关系示意图
作者等人优化了该二维液相色谱方法，考察的主要内容包括第一维色谱流速、分析时间、第二维有效峰容量和分流比，见图1。由图1可知最佳方案为流速为1.0 μL/min，第二维分析时间为10min，分流比4:1。由于花青素类化合物含量较低，需要较高的灵敏度，最终选择的方法是第一维色谱流速为1.0 L/min，第二维分析时间为2min，不分流。
采用该方法分析放置一年和六年的红酒中的花青素类化合物，500nm下二维紫外吸收图见图2、3。通过化合物保留时间和多级质谱数据分析，鉴定的花青素类化合物94种，包括酰基化的花青素葡萄糖苷、花青素葡萄糖苷、低聚花青素、花青素加合物和环加成类花青素。
由于该二维液相色谱系统正交性良好，各个类别的花青素类化合物分布较有规律，如花青素葡萄糖苷、低聚花青素和花青素加合物在HILIC色谱柱上强保留，而在RP色谱柱上保留很弱，其均出现在二维色谱图右下部位，而酰基化的花青素类化合物在两种色谱柱上保留均很弱，其出现在二维色谱图左下部位。两种年份红酒中各花青素类化合物分布情况见图4.
图4 红酒中不同种类花青素化合物分布图（a：放置1年；b：放置6年）
该研究建立了一种准确、灵敏的二维液相色谱质谱分析方法，鉴定了红酒中94种花青素类化合物，并应用该方法对不同年份的红酒进行了分析和鉴别。
参考文献：Chandré M.Willemse, Maria A.Stander, Jochen Vestner,Andreas G.J.Tredoux,and André de Villiers. Comprehensive Two-Dimensional Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) × Reversed-Phase Liquid Chromatography Coupled to High-Resolution Mass Spectrometry (RP-LC-UV-MS) Analysis of Anthocyanins and Derived Pigments in Red Wine. Anal. Chem. 2015, 87, 12006−12015
文献整理人：生宁；编辑：生宁 张金兰；第33期