关于CRISPR的技术与八卦
本帖为CRISPR扫盲贴,上半部聊技术下半部聊八卦。
一、CRISPR检测技术篇
1.什么是CRISPR?
Clustered Regularly Inter-Spaced Palindromic Repeats,简称CRISPR。
CRISPR-Cas系统是微生物体内的一种RNA指导的适应性免疫系统。它利用RNA来引导核酸酶与特定核酸序列相结合并且将它们切断。当病毒入侵细菌时,细菌能够捕捉到外来遗传物质的片段并且将它们整合到自身基因组中的CRISPR序列中。CRISPR序列转录生成的CRISPR RNA(crRNA)能够与Cas核酸酶相结合,通过与靶点核酸序列进行碱基配对为Cas核酸酶提供结合特异性。Cas核酸酶和crRNA结合之后,能够在细菌体内起到监控病毒入侵的作用,当与crRNA匹配的遗传片段再度出现时,Cas核酸酶能够切断这些遗传片段,从而提供免疫保护作用。
CRISPR系统的工作原理(Eric S. Lander, (2016), The Heroes of CRISPR, Cell)
在众多天然CRISPR-Cas系统中,2类(class 2)系统只需要一个RNA指导的Cas核酸酶就能够完成对靶点的切割。其中Cas9核酸酶成为了第一个被用于基因组编辑的Cas效应子。CRISPR-Cas12a能够靶向切割DNA序列,Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,专一的切割RNA,不切割DNA。这些由RNA指导的核酸酶系统的可编程(programmability)特点是CRISPR-Cas系统能够在精准基因组编辑以外获得广泛应用的关键。
2类CRISPR-Cas系统(图片来源:《科学》)
2.SHERLOCK
目前已有用于登革热病毒、寨卡病毒和与癌症相关的人乳头瘤病毒(HPV)毒株的CRISPR检测诊断。
3.CRISPR与新冠检测
CRISPR Covid检测的测试流程(图片来源:参考资料[1])
操作步骤
利用常规的同温扩增技术,对提取的核酸样本进行扩增。这一步需要25分钟,维持42摄氏度。
在样本里加入Cas13蛋白,向导RNA,以及起到报告作用的特殊分子。然后在37摄氏度下,继续反应30分钟。
使用试纸对第二步里获得的样本进行检测。这一步大约需要2分钟的反应。
第二版CRISPR检测方法STOPCovid
2020年5月,张锋教授和他在Broad研究所,公布了他们开发的新一代新冠病毒CRISPR检测技术的实验流程。这款最新的检测手段比2月份的检测技术更进一步,检测过程中不需要从患者样本中纯化RNA,并且将检测新冠病毒所需的化学反应步骤在一个试管中完成。研发团队将它命名为STOP(SHERLOCK Testing in One Pot)。
为了让等温扩增步骤和Cas酶检测的化学反应能够在同一个试管中进行。他们选择了环介导等温扩增技术(LAMP)作为扩增RNA的方法。然而LAMP反应需要在温度为60℃的反应条件下进行,而Cas13a在这一温度下不够稳定。研究人员找到了名为AapCas12b的Cas酶,能够在LAMP反应条件下维持足够的活性,同时对指导RNA和反应中的添加剂进行了优化,让Cas酶介导的检测步骤维持足够的灵敏度。在实验条件下,这一检测的下限为100个新冠病毒RNA分子。
研究人员同时简化了提取RNA的步骤,只需要在含有新冠病毒的咽拭子或唾液样本中加入裂解病毒,释放RNA的试剂,无需纯化分离RNA,就可以将释放的病毒RNA用于检测。
STOPCovid检测的测试流程(图片来源:参考资料[2])
第三版CRISPR检测方法STOPCovid.V2
2020年9月,张锋教授和他在Broad研究所公布了他们进一步改良的基于CRISPR技术的新冠病毒简易检测流程。这一流程被称为STOPCovid.V2。2.0版的STOPCovid在原有检测的基础上更进一步,在样本制备的过程中通过加入磁珠富集样本中的RNA,从而通过提高PCR反应的起始RNA数量,进一步提高了STOPCovid.V2的检测灵敏度。
在最初的STOPCovid检测流程中,张锋团队将扩增RNA数目的等温PCR步骤和使用Cas酶检测新冠病毒特定序列的化学反应合并在同一个试管中进行。这一检测步骤不需要复杂仪器,只需要在60摄氏度的恒温反应,就可以通过侧流试纸读出检测结果。然而,在进一步检测中,研究人员发现,这一简易版流程只能发现60.5%传统RT-PCR检测出的阳性患者。
为了提高检测的灵敏度,STOPCovid.v2的流程中加入了通过磁珠富集鼻咽拭子中新冠病毒RNA的步骤,使用普通实验室中用于富集RNA的磁珠,研究人员可以收集鼻咽拭子中包含的所有病毒RNA作为反应的起始材料,而且研究人员同时精简了磁珠富集RNA的操作步骤,去除了乙醇清洗和洗脱过程,让整个RNA富集过程不超过15分钟。
STOPCovid.V2的操作流程(图片来源:参考资料[3])
在华盛顿大学进行的一项设盲检测中,研究人员检测了STOPCovid.V2检验202个新冠病毒阳性和200个新冠病毒阴性鼻咽拭子样本的结果。研究人员发现,STOPCovid.V2能够达到93.1%的灵敏度和98.5%的特异性。阳性样本只需15-45分钟就能获得结果。
二、CRISPR八卦篇
1.CRISPR与诺贝尔奖
2020年10月7日,诺贝尔基金会宣布,近年来火热的CRISPR基因编辑系统斩获本年度的诺贝尔化学奖,在这一领域做出卓越贡献的Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授摘得桂冠。正如人们所说的那样,这一革命性的发现为整个生物技术领域提供了无限可能。
CRISPR技术获得诺贝尔奖是实至名归,但是让人遗憾的一个是居然是化学奖,另一个是张峰痛失大奖。
2.CRISPR三巨头
2012年8月17日,詹妮弗·杜德娜(Jennifer Doudna)和埃玛纽埃尔·卡彭蒂耶(Emmanulle Charpentier)合作,在 Science 杂志发表了基因编辑史上的里程碑论文,成功解析了CRISPR/Cas9基因编辑的工作原理。
2013年2月15日,张锋在 Science 杂志发表了,首次将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于哺乳动物和人类细胞。
自此,近年来生命科学领域最耀眼的技术正式宣告诞生,杜德娜、卡彭蒂耶、张锋三人,也被人们称为CRISPR三巨头。
3.神仙打架
卡彭蒂耶和杜德娜的论文发表后半年,张锋在Science杂志发表论文,将CRISPR/Cas9基因编辑成功应用到了哺乳动物和人类细胞,张锋成了第一个用CRISPR/Cas9编辑哺乳动物细胞基因组的科学家。如果说卡彭蒂耶和杜德娜发现了一座金矿,那么张锋就相当于是最先找到了这个金矿中的金子。如果按照学术界谁先发现就归谁的惯例,CRISPR/Cas9的发现,就成了一笔糊涂账。
一开始,张锋连同杜德娜等人合伙创建基因编辑公司——Editas Medicine,没过多久,杜德娜等人就和张锋等谈判破裂,杜德娜单飞出去办了一家名为Intellia Therapeutics的公司。两个阵营关于CRISPR/Cas9的专利之争,摆上了台面。
[1] A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Retrieved February 14, 2020, from https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e46d16cf617da2f796f926e/1581699437272/COVID-19+detection+%28v20200214%29.pdf
[2]Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. Retrieved May 5, 2020, from https://www.stopcovid.science/docs/STOPCovid%20Whitepaper.pdf
[3] Joung et al, (2020). Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot Testing. NEJM, DOI: 10.1056/NEJMc2026172
[4] Knott and Doudna. (2018). CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science, https://doi.org/10.1126/science.aat5011