【ClinMS Forum专题揭秘】质谱技术在恶性肿瘤分子标志物检测中的应用与临床诊疗前景·专论
作者：张超 张腾练
前言
肿瘤是一种伴随DNA、RNA、蛋白质及代谢物等分子标志物异常表达的疾病。随着肿瘤治疗精准化时代的来临，对肿瘤分子标志物的精准检测变得至关重要。质谱作为一种功能强大的分子检测技术，随着该技术的日趋成熟，目前已实现对一些肿瘤小分子标志物的精准检测，这展现了质谱技术在肿瘤诊断、治疗过程中的广泛应用前景。本文就质谱技术目前在肿瘤DNA、RNA、蛋白质及代谢物等分子标志物应用进行论述，并对质谱技术在未来肿瘤诊疗应用前景做出展望。现研究结果表明，肿瘤的分子水平改变早于细胞和亚细胞层次的改变，而目前分子诊断主要是应用分子生物学技术进行。因为肿瘤和个体之间在DNA、RNA以及蛋白、代谢物之间的表达存在一定差异，所以，肿瘤分子诊断期间需要对相关信号通路进行整理。质谱技术在生物医药行业中的应用十分普遍，液相色谱-串联质谱能定量分析小分子物质，气相色谱-串联色谱能进行挥发性化合物的检测等，具备明显的综合性特征，在分子诊断中具有重要作用。
肿瘤蛋白类分子检测
通过对患者和健康对照或不同疾病阶段水平的定量分析，筛选出具有显著差异表达的蛋白质作为潜在的生物标志物的候选物，质谱技术可对生物标本中的蛋白质多肽进行定性和定量分析，也能分析蛋白质的结合位点，如乙酰化、甲基化、泛素化和蛋白水解等，能全方位的掌握疾病的发生变化过程和治疗疗效情况。应用同位素标记蛋白质组学技术（iTRAQ)定量蛋白质表达的是较为准确的方法之一，然后进行液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS)鉴定。有研究使用iTRAQ结合2D LC-MS / MS两次鉴定了534种蛋白质，发现与健康对照组相比，非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者的S100A8和LRG1蛋白升高，S100A8、LRG1以及S100A8和LRG1组合的ROC曲线下面积分别为0.873、0.898和0.970，提出血清 S100A8 和 LRG1 蛋白是小儿 NHL 潜在的生物标志物，有助于NHL病的诊断[1]。
另有研究发现，使用一级质谱对健康人、肿瘤晚期患者的血浆中酶解后肽段进行检测，发现大约641个肽段为差异性标志物，后期再进行二级质谱分析，通过二维色谱、选择反应监测模式的评估，发现存在2个肽链。健康人血浆无表达，其结果说明2个肽链和卵巢癌诊断特异性标志物有很大关系。还有研究将质谱技术作为基础，对乳腺癌患者、健康人的血浆胞外囊泡中的磷酸化蛋白进行检测，发现有144个磷酸化蛋白在乳腺癌患者中表达显著增加，再利用质谱平行反应监测模式进行标志物的验证，发现血浆胞外囊泡中磷酸化蛋白为肿瘤监测中的主要标志物[2]。另有研究运用LC-MS/MS技术对早期胃肠道癌症痕量福尔马林固定石蜡包埋的样本（FFPE）的综合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学进行分析，探索了早期胃肠道癌症的潜在生物标志物，鉴定了约6 000种蛋白质和>10 000种的磷酸盐，揭示了肿瘤组织蛋白质组学的特征不同[3]。另有研究使用二维液相色谱-质谱（2D LC-MS / MS）检测到622种表达具有统计学差异的不同蛋白质，发现RAB14和RCN3蛋白可能是宫颈癌（CC）治疗中的潜在生物标志物和治疗靶点[4]。
质谱、流式细胞技术形成的质谱流式细胞仪被广泛应用，该仪器是利用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对单细胞进行多参数检测的流式技术，质谱原理实现3个细胞各个参数的检测，其功能不仅包括传统流式细胞仪高速分析的特征，也能发挥较强的分辨能力，实现标志物表达丰度的检测，以获得更精准的细胞分型和高通量数据。目前质谱流式细胞技术在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用，经不同标志物标记组合的设定，能够对免疫应答药物治疗的肿瘤患者的外周血细胞分子特征进行检测，以更好的选择和免疫治疗药物治疗效果有关的细胞亚群，促进对临床生物标志物的详细分析，为临床用药提供重要指导。相关研究发现，基线血中的高比例记忆T细胞是预测对抗CTLA-4药物治疗晚期黑色素瘤患者治疗效果的潜在标志物，还有研究显示，黑色素瘤患者治疗前期血中经典型单核比例与抗PD-1药物治疗后的进展生存期与总生存期没有关系[5]。
肿瘤相关代谢产物的检测
在代谢组学研究中，经常将色谱和质谱技术联合使用，可提高分离能力和灵敏度。肿瘤是一种代谢性疾病，代谢变化发生在肿瘤细胞和正常细胞之间，表现为增殖、侵袭、转移等特点。所以，使用生物质谱、代谢组学方法分析患者的代谢水平，不仅能进行肿瘤生物标志物的分析，也能为肿瘤诊断、治疗提供重要指导，如使用UPLC-QTOF MS与GC-TOF MS技术对乳头状甲状腺癌患者的肿瘤组织和瘤旁组织代谢物进行检测时，发现肿瘤的代谢物与氨基酸代谢、一碳代谢、色氨酸代谢有关，特异性差异代谢物PTC中嘌呤、嘧啶代谢增加，BTA中脂肪酸、胆汁酸增加。使用UPLC-QTOF质谱技术对肺癌患者尿中小分子代谢物进行测定时可发现非小细胞肺癌组织中肌酸核苷、N-乙酰神经氨酸逐渐增加，影响患者的预后。基于LC-MS/MS技术的氨基酸代谢组学在结直肠癌的早期预警、诊断、疗效预测和评估中具有价值[6]。有研究创新运用一种纳米封闭液相纳米萃取（NLPNE）结合纤维内衍生化（IFD）的NLPNE-IFD LC-MS / MS方法，分析血浆中70种含氨基分析物，包括胺、核苷及其代谢物，以确定肺癌血浆中的多代谢物指数，然后通过二元逻辑回归分析建立肺癌诊断模型，为临床肺癌快速筛查提供参考[7]。因此这些研究探索的肿瘤新型标志物对早期发现肺癌和判断预后可能有重要意义[8]。
肿瘤基因检测
基因检测的方法很多，但这些技术使用期间耗时、耗力，成本也较高，还需要研发新技术。核酸质谱技术是将MALDI-TOF-MS作为基础，涵盖了PCR技术的灵敏度、芯片技术的高通量和质谱技术的高精确特点。目前，核酸质谱主要应用在单核苷酸多态性、基因融合、DNA甲基化以及高通量检测，如使用RT-PCR和质谱技术对非小细胞肺癌患者EGFR基因突变情况进行检测时发现，两者检测结果一致，故临床应用质谱技术可对患者的基因突变状态进行快速检测，且该方法的成本低，具有高通量、高灵敏度和全自动化特点，未来将成为临床实验室主要研究的设备[5]。
液相色谱-串联质谱的应用
液相色谱-串联质谱在我国还处于起步阶段，但因其具有灵敏度和特异度高、检测时间短、可以实现多重检测、适用范围广的特点，已成为临床检验工作中重要的前沿检验技术。液相色谱-串联质谱已成为蛋白质组学中的主要分析方法，因其具有高灵敏度、高通量、高稳定性等特点，使得目前在蛋白质、激素和胆汁酸等物质定量比传统的方法更有优势，目前已广泛应用到临床的疾病诊断中[10]。如有研究采用LC-MS/MS技术对肺炎、肺癌和健康人群的进行胆汁酸谱检测，同时检测了常见的肿瘤标志物（CEA和CYFRA21-1），并建立肺癌诊断模型，发现脱氧胆酸（DCA）鉴别诊断肺炎与肺癌的价值最高，这说明胆汁酸谱的变化与肺部疾病的发生有一定关系，而胆汁酸谱有成为肺癌诊断标志物的潜能[11]。使用液相色谱-串联质谱进行儿茶酚胺及其代谢物5项测定，采用内标标准曲线法进行定量，可应用于嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)的辅助诊断和预后评估[12]。液相色谱-串联质谱能实现小分子激素的准确定量。充分利用质谱技术的高通量特点，结合大数据技术的综合分析能力，必将大幅提升生物标志物在肿瘤诊治中的灵敏度和特异性。
展望
随着精准医学水平的提升，医学研究工作中单因素模式逐渐转化为多因素系统模式，且各个组学技术也广泛应用于临床。它与传统的抗体试剂技术相比，基于质谱的靶向蛋白质组学技术已成为发现和验证蛋白质、代谢产物、核酸等生物标志物的强大分析工具。目前，质谱技术的高通量、高灵敏度、准确定量的优势可实现同时检测不同理化性质的化合物，对生物样品的检测限制性、检测周期也会不断缩短。随着质谱技术的广泛应用，目前已发现数量庞大的肿瘤标志物，这些候选的肿瘤生物标志物的临床前筛选、验证、结果分析和临床应用，也面临着巨大的挑战。相信随着新技术的发展，基于质谱技术检测的新兴肿瘤生物标志物将越来越多的应用于临床，为我国肿瘤早期诊断和提高生存率提供理论基础。
参考文献
[1] Yu R, Cheng L, Yang S, et al. iTRAQ-Based proteomic analysis reveals potential serum biomarkers for pediatric non-hodgkin's lymphoma[J]. Front Oncol,2022,12:848286. DOI: 10.3389/fonc.2022.848286.
[2] 刘书霞,韩晓红. 质谱技术在肿瘤分子诊断中的应用进展[J]. 标记免疫分析与临床,2019,26(6):1074-1077.
[3]Li L, Liu H, Li Y, et al. Integrative proteomic characterization of trace FFPE samples in early-stage gastrointestinal cancer[J]. Proteome Sci,2022,20(1):5. DOI:10.1186/ s12953-022-00188-0.
[4] Ramírez-Torres A, Gil J, Contreras S, et al. Quantitative proteomic analysis of cervical cancer tissues identifies proteins associated with cancer progression[J]. Cancer Genomics Proteomics,2022,19(2):241-258. DOI: 10.21873/cgp.20317.
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[10] 贺毅, 梁旭俊, 张鹏飞. 基于液相色谱-串联质谱的单细胞蛋白质组学方法推动肿瘤诊断研究[J]. 中华检验医学杂志, 2021, 44(8):9.
[11] 徐润灏, 邹琛, 张洁,等. 胆汁酸谱在肺炎和肺癌鉴别诊断中的应用价值[J]. 检验医学, 2021, 36(1):7.
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原文以《质谱技术在恶性肿瘤分子标志物检测中的应用与临床诊疗前景a》为题发表在《临床实验室》杂志2022年7月刊专题“恶性肿瘤实验室诊断”-「专论」版块
✍ 本文转载自公众号“金宝话检验”，版权归《临床实验室》杂志所有
会议预告
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刘红星
北京陆道培血液病研究院执行院长/陆道培医院病理和检验医学科主任
报告题目：质谱技术在血液肿瘤精准医疗中的应用从事临床医师工作3年，血液病实验诊断工作20年。以通讯/第一作者发表学术论文130余篇。参与制定血液病实验检验相关专家共识6篇。第七届北京优秀医师；中国非公立医疗机构协会病理专委会常委兼血液病学组组长、中国医药卫生文化协会实验诊断与社会化服务专委会常委、中国抗癌协会肿瘤基因诊断专委会委员、中国抗癌协会临床检验与伴随诊断专委会委员、北京非公立医疗机构协会检验专委会副主任委员、北京免疫学会理事；《分子诊断与治疗杂志》、《白血病•淋巴瘤》、International Journal of Medical Reviews 编委。
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李士军
大连医科大学检验医学院院长/大连医科大学附属第一医院检验科主任
报告题目：基于质谱技术的肿瘤标志物筛查教授，博士研究生导师,长期从事肿瘤分子基因诊断及肿瘤免疫机制研究,中国老年医学会检验医学分会副会长,中国医师协会检验医师分会第四届委员会委员,中国医院协会临床检验管理专业委员会委员,中国中西医结合学会检验专业委员会委员,中国医学装备协会临床检验装备技术专业委员会委员,辽宁省免疫学会副理事长,辽宁省医学会检验分会副主委,大连市医学会检验专业委员会候任主任委员。《中华预防医学杂志》《实用医学杂志》特约审稿专家。主持国家、省市级课题多项，在SCI和国家级核心期刊发表论文50余篇，主编或参编各类规划教材15部。
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吴效科
黑龙江省医院院长
报告题目：基于质谱的蛋白质组学修饰组学在肿瘤筛查中的应用中医妇科学专家，全国政协委员，黑龙江省政协常委， “国家中医临床研究基地”首席专家；黑龙江中医药大学“中医妇科学”国家重点学科带头人、科主任，是2015、2019 及 2021 年度中国工程院有效候选人，并成为2021 年度中医药届所有候选人中进入二轮的 4 位候选人之一。1988 年，吴效科毕业于徐州医学院（现徐州医科大学），获医学学士学位；1994 年，毕业于上海第二军医大学，获妇产科学硕士学位。1996 年，毕业于南京大学，获理学博士学位。1999 年，赴芬兰图尔库大学进行博士后研究；2005年，在黑龙江中医药大学从事中医妇科学博士后相关研究；1988 年本科毕业后，分配至江苏省睢宁县人民医院妇产科，任住院医师；2001 年9 月，任南京大学医学院/南京军区总医院妇产科，副教授及硕士生导师。2004 年3 月，任黑龙江 2 中医药大学附属第一医院，妇产科主任、教授、博士生导师；2005 年5 月，兼任国家中医药管理局重点实验室主任（中药药理学）；2009 年3 月，任国家重点学科（教育部）中医妇科学，学科带头人；2019 年9 月，任黑龙江省医院院长；2021 年 3 月，当选黑龙江省政协委员;2023 年 3 月，当选全国政协委员。吴效科教授长期致力于中医药服务妇幼卫生和人口健康事业，注重运用现代科学技术“讲明白”中医药原理，探索循证医学证据“说清楚”中医药疗效，发声于国际舞台。经历具有从“基层”到“海外”、从“部队”到“地方”、横跨“南北”地域和“中西医”领域的特点，励精图治学科发展 20 年，使黑龙江中医妇科再度成为国内排名第一和显著“国际化”影响力的一流学科。
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唐惠儒
复旦大学特聘教授
报告题目：大型人群队列的定量代谢组学分析与挑战国家杰青、“精准医学”及“前沿生物技术”国家重点研发计划项目首席科学家、英国皇家化学会会士、中国生物物理学会代谢组学分会主任委员。曾任英国BBSRC食品研究所及帝国理工学院医学部Senior Scientist、“中科院生物磁共振分析重点实验室”创建主任、科技部973与蛋白质科学重大计划等项目评审专家。研究代谢物结构功能及代谢组学30余年，发表Nature、Nat Microbiol、PNAS等SCI论文210余篇，被引1.3万余次（h指数~64）。获批国内外发明专利多项。现任中国生物化学与分子生物学会脂质与脂蛋白委员会常务委员、中国抗癌协会肿瘤代谢分会及中国营养学会基础营养分会常务理事、国际实验磁共振大会（ENC）执委（大中华地区唯一），Metabolomics、Arch Pharm及《基础医学与临床》等编委，Nutrition Metabolism及Phenomics等副主编。
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