大样本研究正当时！3大难点，一举攻克
随着精准医学和大数据学科的发展，人群队列研究由传统小样本队列发展到了当下火热的大型队列，而代谢组学作为研究表型性状和发现生物标志物的有力工具，已经被广泛地应用于大规模、长时间、多中心的临床队列样本研究中[1-4]，这极大地加速了精准医学的发展进程。
然而，由于进行代谢组学研究的色谱质谱联用仪是一个十分复杂精密的仪器系统，随着检测时间的推移、检测样本的增多，仪器的状态和信号响应会发生变化，可能导致系统误差。涉及几百上千例样本的临床队列研究，仪器检测时间长跨度长，长达几周甚至数月，检测分析方法的稳定性和重现性尤为重要，会极大地影响到统计学分析的结果以及最后得出的结论。
代谢组学大样本研究面临的难题：
1. 如何保证样本制备时实验操作的一致性？
2. 如何实时监控仪器的稳定性，连续稳定地进行数据采集？
3. 如何整合庞大的数据，并合理科学地进行数据校正和统计分析？
Q
那么，怎样才能在研究中解决这些难题呢？
就在近日，华大科技质谱团队用实例为大家打了个优质样板，团队使用Q Exactive（Thermo，USA）质谱仪完成了2000例人血浆样本的代谢组学检测分析。该项目分为9个批次进行检测，所有样本仪器检测共计70天。样本制备环节加入了14种同位素内标与样本一起进行代谢物提取，所有内标峰面积的CV均小于10%（内标信号响应稳定），检测分析方法表现出了极好的稳定性和重现性，为后续的统计分析和差异代谢物筛选提供了可靠的数据基础。正离子模式下的部分质控结果展示如下：
图1 A. QC样本的BPC重叠图：从检测开始到结束，QC样本的BPC图高度重叠，保留时间和信号响应均有良好的重现性；B. 所有样本的PCA得分图：QC样本聚集紧密；C. QC样本的相关性热图：QC样本的相关性高，批间差异小，相关性系数最小值为0.975；D. QC样本的CV分布图：QC样本中信号响应稳定的峰（CV≤30%的峰）占比达到了87.1%
以上几点均说明，整个检测分析方法具有良好的稳定性和重现性，检测结果准确可靠！
Q
那么在课题研究中，如何才能重现这样优秀的结果呢？
这成功案例的背后，是为了攻克上述三点困难，华大科技质谱团队针对性地开发了有效解决方案：
1 · 规范化代谢组学平台
保证实验操作一致性
华大科技一直以来都致力于建立质谱平台组学技术标准化，进行规范化管理。各个代谢组学产品均配套有完善的标准操作程序（SOP），从样本入库、样本制备、上机检测到数据分析，全流程标准操作、严格质控。
对于样本数多的项目，华大科技采用自动化样本制备系统进行代谢物提取，单日处理样本通量可达到1000+，实现规模化样本制备，大大加快了样本制备速度，并减少了人为误差。
规范化平台结合先进的检测仪器，能够满足代谢组学大样本研究对检测分析方法长期保持良好重现性的高度要求。
图2 华大代谢组学质控体系
2 · 实时监控仪器检测过程
1. 内标质控
在样本制备环节，每个样本中加入相同体积相同浓度的多种同位素内标与样本一起进行代谢物提取。仪器检测时，利用分析软件提取内标峰，通过查看内标的质量偏差、保留时间和信号响应的波动情况来判断仪器的稳定性，实时精准把控检测过程，及时排除问题。内标除了监控仪器的稳定性，还能反映样本制备环节操作的一致性[5]。
图3 正离子模式下多种同位素内标的XIC（内标覆盖整个液相梯度进行质控，出峰良好，m/z 质量精度在 5 ppm 范围内）
2. QC质控
每个待测样本取相同体积的提取液进行混合，得到用于质控的QC样本。在正式检测样本前先连续进样5-10个QC样本，对仪器系统进行预平衡，待仪器状态稳定后再进行正式测样。在连续进样检测过程中，每间隔10个样本，插入一个QC样本进行检测。通过QC样本的TIC图或BPC图的重现性，评估仪器的状态和稳定性[5,6]。
图4 代谢组学进样顺序示意图
3 · 精确算法校正系统误差
对于单个项目样本数量较多的情况，我们建立了分批次检测方案[5,6]，每批次检测200例左右样本，每批次间进行仪器维护，主要是清洗离子传输管和校正质量轴，让仪器保持良好的状态。数据分析时，使用自主开发的代谢组学数据分析软件包metaX[7]进行数据分析，采用PQN（Probabilistic Quotient Normalization）和QC-RLSC（QC- based robust LOESS signal correction）算法对整体数据进行信号校正，可以整合不同检测批次的代谢组学数据，也能有效消除系统误差对大样本代谢组学项目的影响，进而进行全面的统计分析。
通过这三大方式，实现了操作一致、检测过程可控、问题排查及时、有效校正系统误差，解决了大样本代谢组学研究的难题！选择华大科技，轻松助您实现优质结果！
华大科技质谱平台始建于2007年，截至2020年9月，华大在蛋白质组学和代谢组学领域发表研究文章228篇，累计影响因子1000+，包括Nature Medicine、Nature Communications 等高水平文章[8,9]。在代谢组学大样本研究方面，更有丰富的经验积累！
华大科技不仅提供高质量的检测分析服务，同时也提供专业的技术支持，可为广大科研用户提供完善的方案设计。如果您有开展代谢组学研究的计划，赶快联系我们吧~
图5 华大代谢组学-脂质组学整体解决方案
表1 华大代谢组学产品服务列表
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参考文献：
[1] Nemet, Ina, et al. "A cardiovascular disease-linked gut microbial metabolite acts via adrenergic receptors." Cell 180.5 (2020): 862-877.
[2] Moreau, Richard, et al. "Blood metabolomics uncovers inflammation-associated mitochondrial dysfunction as a potential mechanism underlying ACLF." Journal of hepatology 72.4 (2020): 688-701.
[3] Chen, Dan-Qian, et al. "Identification of serum metabolites associating with chronic kidney disease progression and anti-fibrotic effect of 5-methoxytryptophan." Nature communications 10.1 (2019): 1-15.
[4] Liang, Liang, et al. "Metabolic Dynamics and Prediction of Gestational Age and Time to Delivery in Pregnant Women." Cell 181.7 (2020): 1680-1692.
[5] Dunn, Warwick B., et al. "Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry." Nature protocols 6.7 (2011): 1060-1083.
[6] Want, Elizabeth J., et al. "Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC–MS." Nature protocols 5.6 (2010): 1005.
[7] Wen, Bo, et al. "metaX: a flexible and comprehensive software for processing metabolomics data." BMC bioinformatics 18.1 (2017): 183.
[8] Liu, Ruixin, et al. "Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention." Nature medicine 23.7 (2017): 859.
[9] Gu, Yanyun, et al. "Analyses of gut microbiota and plasma bile acids enable stratification of patients for antidiabetic treatment." Nature communications 8.1 (2017): 1-12.
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