Biological Psychiatry: 童年的社会隔离对大鼠大脑功能连接性的影响

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      为探究精神疾病中早期社会压力领域的一般风险因素，对断奶后社会性隔离（post-weaning social isolation, PWSI）饲养的啮齿类动物进行观察，获得对于例如精神分裂症在内的神经发育疾病可解释性，目前已经成为了一种广泛使用的动物研究模型。但是在动物模型中，与其相关早期社会压力引发的相关影像学特征研究还很匮乏。

       在本文的实验中，作者采集了断奶隔离3周后的大鼠静息态功能核磁数据，以研究精神障碍患者（主要是社会孤立代理的孤独症精神症状）的连接变化，通过基于种子点到全脑的连接分析，研究了前额与后部脑区的功能连接的变化。另外为研究区域网络以及全局拓扑属性的变化，作者使用基于图论的分析方法进行研究（包括节点属性和全局属性）。结果发现，经历断奶后社会隔离（PWSI）的大鼠在以前额部分脑区作为种子点的功能出现减弱，而大脑后部则相反。基于图论的分析揭示了相似的结果，同时这种改变与行为结果相关，在隔离分饲大鼠中还伴随模块性的降低。

由上述分析，本文支持了前人研究中对于预设社会神经回路包含前额脑区的设想，这种神经回路的改变可能是社会压力导致精神障碍风险的关键通路。通过说明这种以中心性以及非模块性改变为主要特征，由早年社会生活压力而引发的全脑范围的脑网络组织方式改变，引起了与孤独症行为相关的表现。另外该研究结果与人群中如精神分裂，自闭症以及注意力不集中引发的多动症等神经发展性精神障碍中的核心变化高度相似。

引言

      稳定富足的环境往往更能培养出健康的心理，而暴露于不良的社会环境则容易诱发心理疾病。流行病学研究表明处于贫困、歧视对抗环境或者被社会隔离的人群有更大的风险引发心理疾病。而越来越多证据表明心理疾病往往是有先天的基因与后天生活的社会环境导致的。在早年生活中经历母子分离与社会性隔离这样的环境下将会消极的影响大脑的发育，这也是导致精神疾病的重要原因。

      神经发展阶段社会压力的负面影响对精神分裂、孤独症谱系障碍（Austim Spectrum Disorder, ASD）以及注意缺陷与运动障碍(Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD)的形成起着重要的作用。伴随着大脑前额相关信息作为诊断特征的改变，神经回路研究对上述疾病出现了广泛的影响。大量的研究也表明前额脑区的功能连接减弱是精神分裂中的一大特征，而类似的情况在ADHD和ASD患者中也有发现。另外，前额叶功能连接降低导致认知控制机制的崩溃，使得这些疾病中常伴随认知退行的症状。近来在这些精神障碍患者中越来越多大脑功能改变的发现被报道出来，使得人们的关注点由大脑局部异常转向全局范围内脑网络组织结构的紊乱。例如，曾有研究使用基于图论的分析方法，发现精神分裂患者相较于正常人存在脑网络组织的失调，而因此导致局部以及全局范围内网络架构的异常。将类似的分析方法迁移到ASD以及ADHD等精神失调患者的研究中去，也发现了相似的脑网络改变。

       动物模型为人们对特定精神疾病的研究提供了可能，也为治疗方法的研究提供帮助。关注于早期生活压力风险因素的研究人员常以断奶后隔离饲养的啮齿类哺乳动物作为实验对象，研究早年生活不幸对于精神疾病发展的影响，这种研究范式作为一种通用的研究方法被广泛应用于大脑发育关键阶段研究社会压力对其影响。尽管一开始就把这一动物模型用于精神分裂症患者的研究之中，但是人们往往只关心长期的行为活动、形态发育以及神经化学方面等相对具有代表性的特征。前脉冲抑制缺失作为一个感知运动损伤的指标在动物模型中也有发现，结合在空场测试中快速运动分析，可将测试得分作为孤立综合征的判断依据（Prepulse Inhibition、PPI，注释：在强的震惊反射刺激出现之前20~500ms内对实验动物施加一个本身不能引起震惊反射的声音刺激，可以将震惊的幅度减小80%。这种在强烈的震惊反射刺激出现前的一段时间内出现的弱感觉刺激对震惊反射的抑制作用就叫做PPI，它是一种大脑适应复杂环境的感觉运动门控过程，注意等高级认知过程可以自上而下的调节PPI，PPI及其高级认知调节异常与多种精神疾病的病理心理机制有关。）。

       综上所述，考虑到社会生活压力对于脑功能的影响，以及在大多数神经发育性疾病中广泛存在的脑网络改变，PWSI大鼠大脑连接性的详细研究十分匮乏。本文致力于使用核磁影像学方法实现PWSI大鼠早期社会生活压力相关性的描述性解释，以及在神经发展障碍早期患者中观察其主要的功能连接的变化。

        基于精神疾病患者额区大脑连接性的改变，作者首先采用基于种子点到全脑的方法研究种子点到额区连接性的变化，由于在动物神经发育模型中还观察到了枕区部分连接性的变化，所以将基于种子点的分析也扩展到枕区部分的分析。为了探究全脑范围内更加广泛的脑网络组织方式的改变，本文使用了基于图论的分析方法。使用一些局部指标来评估PWSI大鼠区域性结构调整和网络枢纽的改变。随后对脑网络的模块性、集成性、隔离性以及小世界属性等方面进行了全局拓扑属性的分析。该研究发表在Biological Psychiatry杂志（添加微信号siyingyxf或18983979082获取原文及补充材料）。

方法与材料：

      所有大鼠均在德国曼海姆中央心理健康研究所的动物设施中饲养。 在出生后第28天给23只雄性Sprague Dawley大鼠断奶，并随机分配至群体饲养组（n = 12）或单独的隔离饲养组（n = 11）。

行为学分析：

      核磁影像学数据采集前为确定孤立综合症的产生，首先对实验对象作空场环境下的过度运动测试以及声音恐吓刺激下的感知运动门控阈值下的前脉冲抑制响应（其实就是我们前文备注中的听觉惊恐刺激）。检测统计使用基于置换检验的非参数检验方法，进行一万次随机值置换以检测组间差异的显著性。

数据采集与预处理：

      大鼠隔离饲养9周之后，使用布鲁克9.4T小动物磁共振成像仪采集大鼠功能与结构数据，使用异氟烷进行麻醉，图像采集期间仅使用美托嘧啶作镇静处理。

      处理上相较于以往的影像学分析流程，这里特别加入逐帧错位检测(framewise displacement，就是前后图像的相对位移距离)以及异常点检测(scrubbing，即数据质量不符合的时间点图像)功能，以保证最终的数据质量。

前额与枕叶部分基于种子点的分析：

       使用基于种子点的分析方法来评估大脑局部连接的改变，基于前人的研究可以了解到这种区域特性的改变是精神分裂、ASD、ADHA以及受逆境影响的主要特征。因此，基于Schwarz提出的大鼠核磁脑图谱选择了4个双侧脑区作为种子点，计算种子点到前额部分的功能连接。这些种子点包括眶额叶皮层（orbitofrontal, OF）、前边缘皮层（Prelimbic , PL）、边缘下区（infralimbic , IL）以及额叶皮层（frontal association cortex, FrA）。此外，还将枕部脑区（视觉核心,visual cortex, V）也纳入研究范围进行了分析，以此来说明在孤独症患者以及神经发展阶段的大鼠模型发生强烈的功能连接改变。

        对于得到的相关分析的统计图在SPM作团块水平的多重比较矫正，体素级别显著性设置为0.001，FWE矫正显著性设置为0.05，以限制假阳性的结果。

Figure 1 voxel-wise FC的种子点

图论分析：

网络构建与连边密度设置：

      各个大鼠脑网络的构建基于Schwarz提出的包含43个脑区的脑图谱，以各个脑区的平均时间序列构建加权脑网络。得到的皮尔逊相关矩阵按照其最大值作标准化，从而构建功能连接图。脑网络拓扑属性的计算使用BCT（Brain Connectivity Toolbox）工具包计算。属性的计算为了更加系统的反映差异而不受某一特定密度的影响，在只保留正连边的前提下从33%到50%之间以1%为步长计算若干密度下的网络属性并计算曲线下面积。对于33%到50%这个密度取值范围的确定基于以下的几点小观察：

      1）在稀疏度低于33%时，有超过5%的节点在网络中失去了与其他脑区的连接；

      2）相较于较低的稀疏度在上述范围内，其组间差异相对较为稳定；

      3）先前的研究也表明当网络的稀疏度大于50%时，脑网络结构就会开始变得随机起来。更为重要的一点是上述33%到50%的网络稀疏度会更加符合前人在研究人与动物脑网络变化的设定。

局部指标分析：

       为评估网络结构的局部标记的变化，使用了连接强度（Strength）、介数中心度（Betweenness Centrality Index ,BCI）以及归一化局部效率（Normalized Local Efficiency, NLE）这三个广泛使用的局部指标进行评估。其中，连接强度来自于脑网络中节点所有功能连边的加权和；BCI（介数中心度）可反映某脑区作为重要节点连接各个独立模块的重要性，而局部效率（LE）则可以定量地反映节点与临近节点作信息交换的效率。组间差异的统计通过打乱分组标签的方式作置换检验（10000次置换，p<0.05）。多重比较矫正使用Bonferroni矫正，设置矫正的显著性水平p<1/n=0.023。通过局部指标筛选数值较大的节点，将其看作网络中较为重要的组成部分。按照以上的设定，本文定义若一个节点的两个或更多的局部指标大于80%的节点，就将其视作一个重要的中心节点（在定义网络中的重要节点上是存在多种方法的，具体研究中选用的方法往往是与具体问题相关的，比较普遍的方法是根据节点的度值、连接强度以及其他节点属性的高低进行排序来定义的）。

      在探索局部架构的变化之后，用斯皮尔曼相关分析的方法研究了与之密切关联的行为结果，利用Bonferroni多重比较矫正方法降低结果中的假阳性。除此之外，还将分组作为一项干扰因子，利用偏相关分方法去除分组的影响比较其相关性。

全局属性以及模块性评估指标

      全局脑网络结构通常可以描述为一个集成性与分隔性相同统一的整体，集成性体现在大脑作为一个有机统一的构成，分隔性则体现在其可视为多个独立功能模块之间相互联系构成的庞大系统。对于大脑整体性的分析，计算了全局效率（GE）、平均局部效率（mLE）、集聚系数（CC）、特征路径长度（CPL）、小世界属性以及抗特定攻击的稳定性（R(targ)）和抗随机扰动的稳定性（R(rand)）等多个指标来进行评估。集成性指标(GE，CPL)表征了大脑快速整合来自不同脑区信息的能力；分离性指标（mLE,CC）等则表明大脑在专一化数据处理的能力。小世界属性则说明其平衡上述任务的能力。稳定性则说明网络抵抗扰动的能力。

      还更近一步对前人在诸多神经发育性疾病中所观察到的模块性减弱现像进行测试。使用相当的随机网络图保留节点数、度和权重分布作为参考进行归一化，作为曲线下面积的计算和组间比较与局部指标相似。

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结果：

自闭综合征的行为测试：

      在不同量级的声音刺激下，PWSI（断奶后社会性隔离）大鼠中前脉冲抑制大量降低，在80分贝时与对照的差异呈现显著性（p<0.05），在84分贝后达到边缘显著（有产生差异的趋势而不显著，其实在当前的科研背景下，如果出现p值接近0.05但未小于，为了避免更多的争议，做不显著讨论更合适）。空场测试中孤立大鼠的运动能力呈现显著的差异（P<0.05），而其他测试指标上并未出现显著差异（P≥0.05）。这里的行为测试说明，相对于控制组的大鼠，PWSI的大鼠已经产生了类孤独症患者的明显的疾病行为症状，在前述分析中我们说过，孤独症患者及精分、抑郁患者等都会产生前脉冲抑制显著降低的情况。

Figure 2 A:不同声强下PPI的差异;B:存在差异的运动指标

Figure 3无差异的若干行为指标

基于种子点的差异呈现出前额部分连接的减弱和枕部连接的增强：

      按照假设在前额部位的连接呈现出低连通性，而实验中也发现孤立大鼠相较于对照组前额两个种子点的连接呈现出显著降低的趋势。具体来说，IL(边缘下区)相对与OF在左侧半脑呈现出较低的功能连接，而OF(眶额叶皮层)与左侧脑区在初级躯体感知皮层和右侧尾壳核的连接较少。而在视觉核心则发现了反效果，在PWSI大鼠中，S1中双侧大脑功能连接显著增加，小脑的部分区域功能连接显著增加。

Figure 4 A:以IL(边缘下区)为种子点的前额区连接差异 ;

B:以OF(眶额叶皮层)为种子点的前额区域功能连接差异;

C:以视觉核心为种子点的后部功能连接差异

局部图论指标揭示局部网络结果的改变：

     局部图论指标的结果支持了上文中基于种子点的观察，表现出前额区域整合较低，而后部脑区的整合较高。在图5中，我们可以看到，属于全脑网络中核心节点的前额OF在介数中心度和局部效率上，PWSI大鼠都显著小于对照组大鼠，而在与后部颞、枕连接紧密的属于感觉运动网络的中心节点M1(初级运动皮层)、S1(初级感知皮层)和V(初级视觉皮层)上，PWSI都呈现出了在不同局部属性上的增强，图6中的非核心节点的局部指标的分析也是相同的结果。这些都说明，前文中基于种子点的研究结果是可重复的，是一个鲁棒的结果。

Figure 5 :各指标存在显著差异的若干脑区

注释：b中，红色节点为属于前额网络的全脑核心节点，蓝色为属于感知运动网络的全脑核心节点，黑色为全脑其他节点，核心节点的定义看前文。

     中心节点的分析中，这些被认作中心节点的脑区大多位于前额处、感知运动系统的部分脑区或视觉处理系统之中。孤立大鼠的前额区中心节点呈现较低的BCI(介数中心度)和LE(局部效率）。相对的是位于感知运动和视觉处理系统的中心节点呈现处更高的强度、BCI和局部效率。

Figure 6非核心节点区域存在差异的各个脑区

      总而言之，PWSI大鼠的网络的局部属性的改变指向其大脑区域结构性的改变。说明孤立大鼠出现前额的控制主导降低而伴随非前额脑区的控制增强。

与局部指标改变脑区相关的行为改变的相关性分析：

      孤立动物主要中心节点的改变与由中心脑区控制的相关空场行为测试和脉冲抑制退行存在相关。详细来说，本文发现在OF脑区的BCI属性与空场中的活动性是负相关的，说明前额脑区的节点属性的下降导致了大鼠更差的活动性。而视觉区的局部效率与运动表现呈现正相关。此外还发现S1脑区的高强度与脉冲抑制退行存在联系。这些分析表明：PWSI大鼠的孤独症行为与其特点脑区的网络属性的改变是存在显著关系的。

Figure 7功能连接差异行为测试的相关性分析

全局属性的分析：

      全局属性的比较增强了对大脑整体网络结果的认识，揭示了大脑分非模块化的特性。在尝试寻找全局网络的拓扑结果改变时，本文没有在各个全局网络属性上发现显著的组间差异。但是，在模块化分析方面，发现PWSI大鼠中的模块化显著降低了。由于模块的数量变化以及模块体量的大小都会对模块化属性的计算产生影响，为探究两个因素对于计算有何影响，本文使用置换检验的方法作一万次置换，但是并未发现两个参数对模块化划分的显著影响。PWSI大鼠的模块化程度的显著的降低，或许可以说明PWSI大鼠比对照更加难以将大脑划分出特定的网络模块。即PWSI大鼠在局部的拓扑结构的改变可能导致了其在特定网络模块结构方面的功能受损。

Figure 8两组之间全局指标与模块性分析的差异图

Figure 9对照组与实验组中心节点的对比

      本文未找到两组之间更具代表性的模块划分方法，作者使用多重群落检测方法（在网络分析当下最常用的模块化检测方法，或者也叫“社区发现”），由图9可看到模块化结构的差异，可以看出总体上两组的划分之间的良好一致性。

总结：

      本文首次证明了社交孤立对大鼠大脑功能连接产生的深刻影响，结果表明早期社交压力作为精神障碍发展风险因素跨学科诊断的神经机制。研究发现，隔离饲养的大鼠，与社会神经认知相关的额区的功能连接有所减弱，而后部枕区的连通性提高了。由网络的角度出发，证明了网络的中心向后转移的变化，而与之相关的行为活动也发生相应的变化。并且，本研究也发现这种改变并不局限于某一特定脑区，而会在全脑范围内产生影响，这表明早期的社交压力会对大脑产生更加广泛且复杂的影响。更为重要的是本文的结果与精神分裂，ASD以及ADHD等精神疾病的结果一致，说明了孤立大鼠与精神分裂的相似性。

总体而言，本文的验证过程是严密的。首先，通过了在前脉冲抑制退行与空场中的过度反应的测试，证明动物模型行为判断患病的有效性。这与前人研究中这两项行为作为稳健表征的一致性，并可用其对孤立综合征进行评估。然后，对小样本的研究进行了更为鲁棒的非参数检验方法。最后，本文的发现可以总结为以下三点：

      第一，发现PWSI大鼠基于两个前额部位种子点的功能连接出现持续降低。额部连接性降低的结果显示出与前人的在精神分裂症的神经发育动物模型相一致，说明前额脑区的破坏可能是诱发该类疾病的核心机制。

      第二，本实验发现了PWSI大鼠脑网络拓扑结果的异常改变，详细来说即伴随额区中心节点的减少，非额区中心节点逐渐增多。而后者这些节点往往位于后脑的感知运动系统。

      第三，本结果为证明早期社会隔离而引发，以模块化程度降低为主要特征的全脑网络体系重建提供了证据。该结果与神经发育障碍患者群体的研究一致，社交隔离或许是导致这一变化的重要因素。社会压力可能在脆弱的发育时期引起大脑网络的异常连接性，特别是额叶大脑区域异常连接性的结果，为社会危险因素在神经精神疾病发展中的重要性提供了进一步的证据。

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