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10X单细胞3'转录组建库原理

Zan seqyuan 2022-08-10

10X Genomics公司的单细胞3'转录组解决方案主要有V2、V3两个试剂版本,V3版本是相对于V2版本的升级,实验过程和基本原理相同,以下我们将回顾10X单细胞3‘转录组的建库原理,其中会涉及V2、V3两个试剂版本在文库结构上的异同。

Gel Bead schematic

Schematic of a SC3’ v2 Gel Bead oligo primer

Chromium Single Cell 3’ v3 Gel Bead schematic


V2和V3版本的实验过程和基本原理相同,用于生成3'基因表达文库的Gel Bead poly(dT) Primers差异主要是UMI随机序列长度从10bp增加到了12bp,UMI多样性增加,相应的Gel Beads上Primers的数量也从73多万种增加到350多万种,在相同测序深度下V3能发现更多的基因;GEMs(油包水)数量未有改变,还是能鉴定500-10,000个细胞。

除以上之外,Single Cell 3ʹ v3 Gel Beads还提供另外两种primer(Capture Sequence 1 and Capture Sequence 2),这两种primer能够分别用于Feature Barcoding技术的细胞表面蛋白表达鉴定以及单细胞CRISPR筛选,这两种后续文章会专门讲。

主要实验过程

主要实验过程如下图

含有细胞的油滴占所有油滴比例大约5%,更好的保证了含有细胞的油滴里面只有1个细胞,一个包含细胞的油滴内就是一个单细胞scRNA-Seq。

每个GEMs内包含独特的10X barcode用于区分不同的单细胞;

每个GEMs内相同的10X barcode与不同的UMI组成用于区分不同转录本的Gel Bead poly(dT) Primers。

V2版本试剂产生的文库结构:

V3版本试剂产生的文库结构:

Adapter and primer sequences

各引物序列总结如下:

Beads-oligo-dT

Template Switching Oligo (TSO)

5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrGrG -3'

cDNA Forward primer

5'- CTACACGACGCTCTTCCGATCT -3'

cDNA Reverse primer

V2: 5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT -3'

V3: 5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG -3'

Illumina Truseq Read 1 primer

5'- TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT -3'

Illumina Truseq Read 2 primer

5'- GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT -3'

Truseq adapter (double stranded DNA with a T overhang)

Library PCR primer 1

5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTC -3'

Library PCR primer 2

5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[8-bp sample index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGT -3'

Sample index sequencing primer

5'- AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC -3'

Illumina P5 adapter

5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC -3'

Illumina P7 adapter

5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT -3'


rGrGrG的作用是:提高结构稳定性,利于TSO引物跟多出来的C结合,文献里也是试了很多种不同的TSO3’端结构和修饰,这个rGrGrG在测试结果表现优良

Step-by-step library generation

V3版本试剂产生的文库结构:

到底是怎样的实验过程使Gel Bead poly(dT) Primers与成熟的mRNA组合形成了这样的文库结构呢?

这一章节我们将Step-by-step 解读文库的产生。


0

Inside individual GEMs

每一个GEMs均是Gel Bead + Master Mix + Cell Lysate的混合


1

mRNA捕获、反转录、末端修饰加Cs

在GEM中Beads-oligo-dT引物参与mRNA的捕获,反转录酶采用MMLV,MMLV的末端转移酶活性在末端加Cs。

2

第二链合成

加入TSO引物,TSO的rGrGrG结合第一链的Cs,以第一链cDNA为模版进行延伸。

扩增后的cDNA大约几百ng,文库片段大小集中在1-2kb:

PS:这里的cDNA是全长的转录本,所以从这一步骤之后,如果能够通过片段筛选+PCR循环数及加入接头的选择控制,可以探讨结合三代测序仪实现单细胞ISO-seq的可能

在GEMs中的过程到这结束了,后续的过程是所有细胞的cDNA混合在一起进行处理。


3

加入引物扩增全长cDNA

加入cDNA Forward 和 Reverse primers扩增全长cDNA

不同的细胞数量扩增的循环数不同,对应列表如下:

一般样品的细胞数量为5000,8000,和10000的居多,所以循环数基本是11或12个


4

cDNA片段化,末端加A

使用Fragmentase实现扩增后cDNA的片段化及末端加A修饰,为后续Illumina Truseq adapter的添加做准备

cDNA文库加入Fragmentase后,有3种产物

Product 1 (TSO plus 5'-end of cDNA)


Product 2 (middle of cDNA)


Product 3 (Illumina Read 1 sequence, cell barcode, UMI plus 3' of cDNA)


这个Product3才是我们后续文库构建需要的产物


5

连接Illunina Truseq引物(Read2)

打断后的cDNA中加入Illumina Trueseq adapter Read2(with a T overhang)进行连接,对应上一步会形成3中产物

Product 1

因为TSO的5' end 是被阻断的,所以adapter 只会和cDNA end相连

Product 2

这一部分产物会因为semi suppressive PCR而不能被有效的扩增??,待确定

这部分Product2是不能长在Illumina的FlowCell上被测到的

Product 3

这部分序列在后续PCR过程能够被指数型扩增


6

加入文库PCR引物进行扩增

上一步连接Read2之后加入P5和P7,加入P5和P7,结合Read1 Read2进行指数扩增放大文库


这一步扩增的循环数与DNA投入量对应关系如下:



7

Final library structure

经过以上步骤就产生了可直接用于Illumina测序仪上机测序的文库

V2 library:

V3 library:

文库测序

Illumina文库测序先测P5端的Read1,再测Sample Index,最后是测P7端的Read2

1

P5端,测Read1

加入Truseq Read 1 primer以底链为模版测Read1,Read1包括16-bp cell barcode 和 10-bp UMI, 26 cycles (V2), 28 cycles (V3)


2

Sample Index

加入Sample Index测序引物对Sample Index进行测序


3

P7端,测Read2

加入Truseq Read 2 primer以底链为模版测Read2,

参考


1. https://teichlab.github.io/scg_lib_structs/data/CG000108_AssayConfiguration_SC3v2.pdf

2. https://teichlab.github.io/scg_lib_structs/data/CG000183_ChromiumSingleCell3__v3_UG_Rev-A.pdf

3. https://teichlab.github.io/scg_lib_structs/data/CG000185_ChromiumSingleCell3__FeatureBarcode_CellSurfaceProtein_Rev_B.pdf

4. https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/5VgAXpSNhFJBN6XYGIQsY1/008faef1ea0df36bc650505b06900d53/CG000201_TechNote_Chromium_Single_Cell_3___v3_Reagent__Workflow___Software_Updates_RevA.pdf

5. https://teichlab.github.io/scg_lib_structs/data/indexed-sequencing-overview-guide-15057455-05.pdf

Special thanks to


徐护朝



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