单细胞固定RNA分析 | 锁定细胞状态，释放分析潜能
过去十年中，单细胞技术的出现让研究人员能够深入探究和回答那些与人类健康和疾病息息相关的生物系统的更复杂问题。自从单细胞技术在2009年首次亮相以来(1,2)，科学家在免疫学(3,4)、癌症(5,6)、神经科学(7,8)等研究领域充分利用单细胞RNA测序，并发现了大量信息。单细胞测序的魅力和潜力在于能够以足够高的分辨率观察生物学，从而区分稀有细胞类型、发现新细胞类型，并解析隐藏的异质性。
但是，若问题的答案包含在那些因采样时间或地点限制而无法获取的细胞时，您会怎么做？若您能够克服样本处理的物流挑战而获得新的生物学见解，那将会怎样？在我们最近举办的Xperience 2022活动中，我们很高兴与您分享了Chromium单细胞固定RNA分析的更多细节，这款新产品能够解决上述问题，将样本固定带到高通量单细胞转录组学中，扩大样本可用性。
样本固定对单细胞研究的好处
单细胞RNA测序研究的范围和规模在不断扩大，研究人员的目标是分析与患者队列或多个治疗条件或时间点相对应的大量样本。伴随着这些实验目标，在样本采集和处理方面还有一些额外因素需要考虑。固定RNA分析为高通量的批量分析创造了新的可能性，并将实验范围扩展到脆弱或濒死细胞、多个采集点的样本，以及细胞状态可能不断变化的样本。对于研究人员在尝试达到新的研究深度时所面临的众多挑战，这种新方法提供了解决方案。
“对于一些需要长距离运输样本的项目，细胞或组织可能会因为运输过程中的物理撞击或不适当的储存条件而失去活力。在某些情况下，人们需要保存样本来实现更灵活的实验设计；具体而言，它有助于保存在不同实验条件下或不同时间点采集的样本，并将它们合并。此外，研究人员可能对特定生物学状态感兴趣，而体外处理可能激活特定通路，导致某些组织中的状态发生改变。”(9)
保留脆弱细胞或动态的生物学状态
在采集点固定样本后，我们可通过标准的单细胞转录组学来锁定仍难以捉摸的生物学。其他存储方法可能对脆弱细胞来说效果不佳，而反复冻融等常规方法可能造成细胞损伤。除了存储，运输到实验室进行处理也是对样本完整性的潜在威胁。由此造成的某些细胞类型丢失或者死亡或濒死细胞的增加可能会扭曲您的分析结果，从而隐藏样本的真正异质性。同样地，涉及到快速变化样本的研究（比如短时间点的药物筛选，刺激免疫细胞等）也将受益于高效固定，这种操作可保留动态细胞状态，让处理不再紧迫。
将分析扩展到更多样本
您研究的规模和整体情况可能很适合固定RNA分析。在大型实验中，您可能需要在多个时间点采集或在多个条件下检测以开展小鼠、细胞系或类器官研究，如果实验方案要求您一次处理所有样本，那么这些实验将难以承受，且耗费体力。在采集细胞时对其进行固定可以减轻这些大规模实验的压力，让您在方便时处理样本。或许您正在开展一项研究，其中样本来自不同地区，需要运输到中心实验室进行处理。固定能够锁定细胞状态并保留样本质量以便存储和运输，在不影响完整性的前提下将分析扩展到更多样本。
适应日常的操作
您的实验室每天是如何运作的？如果您与核心实验室或中心机构合作，他们的工作时间可能有限，这就限制了接受新鲜样本的时间。当您的样本在无法预测的时间采集时，这尤其重要。另一方面，即使是在您自己的实验室中处理，您也可能会担心不同用户或不同时间的一致性。在使用固定RNA-seq后，您可以存储样本在单次运行中进行批量处理，从而最大限度地减少变化。
消除安全顾虑
抛开这些围绕通量以及样本管理和细胞活力的操作问题，固定RNA分析甚至能够提高研究人员的安全性。如果您的工作涉及到含有感染原或病原体的样本，那么需要在生物安全三级实验室中执行单细胞研究的所有操作，这会很不方便。固定能够消除感染原，为您的实验室工作带来更多自由。
熟悉且易用的流程
Chromium单细胞固定RNA分析采用多聚甲醛（PFA）固定，在采集点保留样本的生物学特性，这能够简化工作流程，将分析扩展到更多样本，而不受时间限制。我们用值得信赖的Next GEM技术开发出一种操作方案，过去用过我们Chromium单细胞基因表达分析的用户都会很熟悉，即使是单细胞转录组学新手也很容易上手。
这个强大的工作流程包括经过优化的示范方案，适合不同样本类型，包括细胞系、原代细胞以及含有脆弱细胞的解离组织。
如上文所述，细胞或细胞核在采集点固定和透化后，就可以安全地存储和运输，而不会影响样本完整性或下游数据质量。在方便时将样本与探针组（覆盖18,000多个基因）杂交，并使用单个样本流程进行单独处理，或者使用混样分析流程在Chromium芯片的单个通道中合并处理多达16个样本。
这一步的分析流程与我们的3’和5’基因表达方案高度相似，需要在Chromium iX/X仪器上进行单细胞微滴生成。在此过程中，连接探针组并延伸以加入独特的条形码，从而保留细胞身份。在构建文库和测序之后，可以使用10x Genomics的Cell Ranger和Loupe Browser软件工具进行分析。
Chromium单细胞固定RNA分析流程概览
固定，还是不固定？
与任何新研究一样，您需要充分考虑您的实验目标以及这些目标如何影响整体实验设计，更重要的是，哪些分析可帮助您达成这些目标。对于单细胞基因表达研究，样本类型、通量能力和特定分析物都会影响这一决策。
物种
固定RNA分析目前与人类样本兼容，很快将与小鼠样本兼容。对于其他物种，单细胞基因表达分析将是最佳选择。
通量
如果您正在处理大量样本，并希望对它们进行批量分析或混样分析，现在有两个选择：固定RNA分析或单细胞基因表达HT（带有3’ CellPlex混样分析）。固定RNA分析通过内置在探针组中的独特条形码实现混样分析，而带有3’ CellPlex的单细胞基因表达HT分析使用与物种无关的标签来标记样本。同样，在鉴定稀有细胞或深度开发细胞图谱时，这两种分析方法都能帮助您最大限度地提高特定样本的细胞通量。
分析物
多组学分析能够为单细胞实验增添惊人的细节，而我们的每种单细胞基因表达分析都提供了同时测定多个分析物的选项。使用单细胞基因表达试剂盒或固定RNA分析的单个样本流程可分析全转录组基因表达和细胞表面蛋白表达。（在我们的兼容产品页面上查找BioLegend的TotalSeq B寡核苷酸偶联抗体，了解抗体组合的更多信息。）
如果您想获得其他的多组学信息，下列分析为您提供了探索更多分析物的绝佳机会，但与PFA样本不兼容。在深入研究免疫学问题时，单细胞免疫分析能够分析配对的全长B细胞或T细胞受体、表面蛋白表达、抗原特异性和基因表达，所有这些都来自同一个单细胞。我们的单细胞CRISPR筛选分析可帮助您直接评估特定的基因编辑或敲低，以及由此产生的基因表达谱（很快还有细胞表面蛋白）。
创新的工具，全新的见解
随着研究不断向前推进以改善人类健康，我们看到新的机会不断出现，有望克服更大型、更复杂研究的挑战。固定RNA分析的开发是为了将研究扩大到更多样本，保留脆弱细胞的生物学状态，并克服阻碍此类研究取得进展的物流挑战。随着单细胞技术有了这些重大进步，科学家们能够研究影响生理学和病理学的分子变化，让我们对疾病进展和治疗的认知有所改变。
我们诚邀您扫码参加即将召开的系列网络新品发布活动，深入了解固定RNA分析以及其他创新技术。
参考文献：