脊髓损伤治疗研究新进展：组织工程神经元中继器能够促进比格犬全横断脊髓损伤后运动功能恢复
研究内容简介
脊髓是沟通脑与肢体的桥梁，全横断脊髓损伤使得脑与肢体失去联系，从而造成严重的神经功能障碍。我国约有近两百万脊髓损伤病人，其中绝大多数为完全或者不完全性瘫痪。目前脊髓损伤临床上有效治疗手段极为有限，伤者往往终身残疾。脊髓损伤后病人会丧失自主运动功能，不光伤者本人痛苦，也给家人和社会带来沉重负担。恢复基本的运动功能，是大多数脊髓损伤病人的首要诉求。
早期，中山大学曾园山团队提出“组织工程神经元中继器治疗全横断脊髓损伤假说”，即在三维支架材料中构建干细胞来源的神经网络组织，再将此组织工程神经网络组织移植到全横断脊髓损伤区，以补充缺损的脊髓组织。移植的神经网络组织能够传导神经信号，接驳中断的传导通路，重建大脑与肢体联系，从而起到神经信号“中继器”的作用。经过近十年的潜心研究，该团队利用小动物模型，逐步筛选出适合脊髓损伤修复的种子细胞类型、细胞因子种类以及生物支架材料类型等，形成具有完全自主知识产权的组织工程神经网络产品，并初步证实这种组织工程神经元中继器具有治疗全横断脊髓损伤的应用前景。
此研究采用前期组织工程方法构建神经网络支架的方法，综合运用神经营养素-3 (neurotrophin-3, NT-3) 及其受体TrkC，通过与施万细胞(Schwann cells, SCs) 共培养，在三维明胶海绵支架材料上诱导骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs) 转分化为神经元样细胞。在体外经过14天培养，此神经元样细胞具备神经元电活动特征，电镜显示彼此间形成大量的突触样连接。细胞与其丰富的细胞外基质以及明胶支架一起，共同形成可供移植的神经网络组织 (附图1)。
附图1：利用组织工程技术在体外构建MSC源性神经网络组织(A)。MSC源性神经元样细胞在三维支架材料中形成丰富的细胞连接(B，箭所示为细胞连接)。其中有些连接具备突触结构特征(C, 箭头与箭分别表示突触前和突触后成分)。利用膜片钳技术能记录到MSC源性神经元样细胞产生的动作电位(D，上图)和突触后电流(D，下图)。B图标尺为10微米；C图标尺为100纳米。
之后，该团队选用长达4毫米脊髓组织缺损的比格犬全横断脊髓损伤模型进行组织工程神经网络组织移植。研究人员观察到，从移植后4个月开始，比格犬逐渐恢复后肢运动功能。脊髓损伤6个半月后，与对照组相比，移植神经网络组织的比格犬的瘫痪后肢运动功能明显增强，部分犬的后肢能持续地支撑体重步行 (附图2)。此外，在水里微重力情况下，移植神经网络组织的比格犬有约1/5的时间呈现前、后肢的协调运动步态 (附图2)。与临床上大多病例类似，对照组的动物瘫痪肢体没有恢复或仅有轻微的运动功能恢复。
附图2：神经网络组织移植有效地促进比格犬全横断脊髓损伤后组织修复与运动功能恢复。与接受支架材料的移植对照组犬相比，在开放场行为学评测中，接受神经网络组织移植的比格犬后肢恢复承重运动(A和B)；在微重力水下踏步机评测中，接受神经网络组织移植的比格犬呈现前-后肢之间的协调性步态(C)。而对照组犬只无承重运动及协调性步态(D)。应用核磁共振成像和弥散张量成像检测表明，神经网络组织移植能明显促进全横断脊髓损伤组织修复和神经束路再生(E-H)。
为了探索移植的神经网络组织修复大动物脊髓损伤的机制，该团队采用生物素化葡聚糖胺顺行示踪、免疫组织化学以及免疫电镜探索功能修复的潜在神经解剖学机制。他们发现，移植的神经元样细胞能存活长达6个半月，并且通过突触样连接与宿主神经环路进行整合，其中包括支配自主运动的皮质脊髓束神经纤维、脑干下行的5-羟色胺阳性神经纤维以及脊髓固有神经纤维等。更重要的是，该团队通过电生理学证实，皮质脊髓束神经纤维与移植细胞之间的整合是具有传导功能的整合(附图3)。这些结果表明，组织工程神经网络组织移植能在脑和尾端脊髓间发挥“神经元中继器”的作用，从而促使全横断脊髓损伤的比格犬恢复承重运动和协调运动，具有重要临床应用价值。
此项研究不仅对神经网络组织的潜在临床应用提供新思路，而且为大动物脊髓损伤模型在脊髓损伤后的神经病学和神经病理学变化的认识提供了更坚实的理论基础，也为脊髓损伤病人恢复基本的运动功能带来新的治疗希望。论文第一作者为中山大学中山医学院的博士生吴国慧，中山医学院的曾园山教授和曾湘研究员为该文章的共同通讯作者。
该研究得到了国家自然科学基金重点项目(81330028)、国家自然科学基金青年项目(31600780)、教育部博士学科点优先发展领域项目(201300193035)、广东省科技发展专项资金项目(2017B020210012)和广州市健康医疗协同创新重大专项(201704020221)的支持。
中山大学中山医学院曾园山教授：医学博士、教授、博士生导师。1980年攻读中山医学院(现中山大学) 硕士研究生，1988年攻读华西医科大学(现四川大学) 博士研究生，1998年在美国印第安纳州大学医学院解剖学系做博士后。回国后，开展成体干细胞移植与脊髓损伤修复机制研究。现任为中山大学组织学与胚胎学系主任、中山大学干细胞与组织工程教育部重点实验室副主任、中山大学脊髓损伤研究所副所长、广东省脑功能与脑疾病重点实验室副主任、中国解剖学会常务理事、中国神经科学学会神经干细胞和组织工程分会副主任、广东省解剖学会名誉理事长、广东省细胞生物学会副理事长、广东省人体生物组织工程学会副理事长。现研究方向是：1.组织工程神经网络修复脊髓损伤；2.电针联合干细胞移植修复脊髓损伤。获得国家重点研发计划项目和国家自然科学基金10项(其中有重点项目、联合基金项目、海外学者合作项目、面上项目)等资助。至今为止，在国际学术期刊上发表学术论文63多篇，其中发表在有影响力的专业性杂志Advanced Functional Materials、Advanced Science、Biomaterials、Journal of Neuroscience、Cell Transplantation等。曾获广东省自然科学奖二等奖和卫生部科技进步奖三等奖。获国家发明专利授权4项和国家实用新型专利授权2项。任国际学术期刊《Scientific Reports》等编委。获国务院政府特殊津贴、柯麟医学奖、南粤优秀教师奖和宝钢优秀教师奖。
课题组主页：
http://zssom.sysu.edu.cn/teacher/540
中山大学中山医学院曾湘研究员：医学博士，2011年博士毕业于中山大学干细胞与组织工程教育部重点实验室，导师为曾园山教授。博士期间从事组织工程构建三维神经网络修复大鼠脊髓横断损伤的研究。2012-2016 年于哈佛医学院附属布列根和妇女医院神经外科系从事博士后工作，与Yang D. Teng 教授合作，从事多模式脊髓损伤转化医学研究。构建国际上首个标准化静压大鼠脊髓挤压伤模型（2015）和首个大鼠下颈段脊髓肿瘤模型(2016)。2015-2016年聘为哈佛医学院附属波士顿儿童医院麻醉系助理研究员。2016年受聘为中山大学研究员。主要从事应用比格犬全横切脊髓损伤模型和建立首个食蟹猴精准半横切脊髓损伤模型等来评价组织工程技术治疗脊髓损伤的效果。近5年来主持或参与5项国家自然科学基金项目、5项美国研究基金及省市级科技项目多项。研究工作发表在包括Biomaterials, PNAS, Neurosurgery等在内SCI收录期刊29篇。获国家发明专利授权两项。研究工作获得美国AANS/CNS Mayfield奖 (2014) 以及广东省自然科学奖二等奖(2018)。
论文信息
Paper information
Wu GH, Shi HJ, Che MT, Huang MY, Wei QS, Feng B, Ma YH, Wang LJ, Jiang B, Wang YQ, Han I, Ling EA, Zeng X*, Zeng YS*. Recovery of paralyzed limb motor function in canine with complete spinal cord injury following implantation of MSC-derived neural network tissue. Biomaterials, 2018, 181:15-34.
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