文献解读 | 空间转录组技术解析人鳞状细胞癌

点击蓝字关注我们

近年来，空间转录组（ST，Spatial Transcriptomics）测序技术以其能够捕获细胞的空间特异性信息而受到强烈关注。在癌症、发育生物学等领域的研究中，空间转录组测序技术更是独具优势，在揭示肿瘤微环境（TME）、发育时序等方面呈现出前所未有的精度，能够对细胞相互作用、基因调控网络等给出基于空间结构的精确信息。

下面，百奥小编就对近期（6月23日）一篇发表在Cell上的，题为“Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma”，利用空间转录组解析人鳞状细胞癌的文章进行解析，带大家了解空间转录组技术的强大，也希望给大家带来思路上的启迪。

研究背景：

上皮癌约占人类恶性肿瘤的90％。其中，皮肤鳞状细胞癌（cSCC）具有原型特征，且是美国第二常见的恶性肿瘤，年发生率超过100万。尽管切除可以治愈，但高达4％的cSCC会发生淋巴结转移，约1.5％的患者死于该疾病。

此前，单细胞转录组测序技术（scRNA-seq）已揭示出许多癌症类型的瘤内异质性，并确定了驱动耐药性、预测转移风险和介导可塑性的细胞群。然而，这类研究由于技术原因，在组织解离过程会丢失空间信息，而这对于理解TME中的细胞相互作用至关重要。近来，空间转录组测序技术的发展使得上述问题得以解决。

在该研究中，作者使用scRNA-seq、ST以及多路离子束成像（MIBI）等技术对cSCC进行了整合分析，揭示了cSCC的空间异质性以及控制相关细胞类型定位和状态的潜在细胞间信号，为进一步研究肿瘤和免疫动力学奠定了基础。

研究概览

研究结论：

1.cSCC的scRNA-seq分析

图1 肿瘤和正常上皮细胞的聚类

图2 肿瘤和正常上皮细胞全外显子组测序

首先，作者对从外科手术切除的10位患者收集的肿瘤以及和部位匹配的正常皮肤进行scRNA-seq，通过质控的48,164个细胞的结果进行无监督聚类（图1），确定了肿瘤和正常上皮细胞以及基质亚型，包括成纤维细胞、上皮细胞、黑素细胞、内皮细胞、B细胞和浆细胞、NK细胞和T细胞、髓系细胞等。对其中的13,922个髓系细胞进一步细分，得到9个亚群。对1,763个NK细胞和T细胞进一步细分，得到11个亚群，这些结果与此前对实体瘤的研究一致。同时，全外显子组测序发现突变状态也与先前的cSCC研究一致（图2）。这些数据证明，该研究使用的cSCC样本具有代表性，可用于进一步分析。

图3 肿瘤和正常角质细胞的聚类、特征基因表达热图和GO富集分析

图4 EMT相关基因的表达情况和评分

于是，作者将样本中的上皮细胞重新进一步聚类、筛选、去除批次效应，于是在正常皮肤中，作者观察到三个主要的角质细胞（KC）亚群，每个亚群均表达已知的代表性基因，包括（1）基础（COL17A1），（2）周期中（MKI67）和（3）分化（KRT1）细胞；而在cSCC中，聚类结果产生了新的肿瘤特异性KC亚群（TSK），表达肿瘤特异性基因MMP10和PTHLH。进一步的富集分析显示，尽管具有共同的标记基因，但TSK在某些方面与正常对应物有所不同，包括I型干扰素通路，糖酵解、缺氧应答、ROS应答、凋亡和终末分化等生物过程（图3）。尤其值得注意的是，富集分析中还显示了TSK与细胞运动、细胞外基质分解、细胞外基质组织相关基因的高表达，提示其与肿瘤侵袭高度相关（图3）。与此一致的是，TSK表达了经典的上皮细胞-间充质转化（EMT）标记基因，如VIM和ITGA5，以及Hallmark EMT基因signature（n=200)的高表达（图4）。

图5 KC亚群的细胞周期情况

此外，作者发现基底肿瘤细胞的增殖频率大约是基底细胞在正常组织中的五倍，而肿瘤和正常分化的KCs在细胞周期上没有差异。在肿瘤中，TSK细胞的细胞周期发生率最低，而基底细胞在肿瘤中的发生率是在正常细胞组织中的四倍（图5）。

以上数据表明，cSCC中的表皮分化在多个关键层面失调：（1）无法完全参与分化；（2）基底细胞迅速增殖；（3）出现表达EMT相关基因的TSK亚群。

2.cSCC的空间转录组测序和分析

图6 2号患者的肿瘤切片的空间转录组分群

图7 2号和6号患者的肿瘤切片的H&E染色、空间转录组分群、TSK得分、高TSK得分群的空间位置、TSK的空间得分及MMP10的空间表达

图8 高TSK得分的亚群在不同患者中的相关性分析

接下来，作者使用空间转录组测序技术对肿瘤细胞群进行了分析。在实验中，共获得了来自12个切片的8,179个捕获点的转录组。作者根据差异表达基因和此前scRNA-seq得到的TSK基因signature（包括MMP10）对空间转录组结果进行了投影，区分出了各类亚群，包括肿瘤相关群、间质或免疫相关群、非肿瘤邻近的间质群和附件群（图6）。其中，高TSK得分群的空间位置在点阵中清晰可辨，各亚群的TSK得分差异及MMP10的表达差异也能明显地体现在空间点阵中（图7）。此外，这些高TSK得分的亚群在不同患者中具有高相关性（图8），证明结果具有普遍意义。

图9 高TSK得分的亚群在不同患者中的相关性分析

进一步分析显示，在边缘清晰的肿瘤中（患者2、6），与TSK相邻的基质富含癌症相关的成纤维细胞和内皮转录物，说明此处是纤维血管的所在。同时，超过80％的高TSK得分点都位于肿瘤的边缘，其余的边缘斑点则富集了基础肿瘤基因（图9），这些结果说明cSCC肿瘤边缘具有高度的异质性。

图10 多位患者的IHC染色结果

免疫组化（IHC）染色进一步支持了肿瘤基底细胞和TSK细胞在边缘的存在，如本研究中所用的COL17A1即是一种共同的肿瘤基底和TSK标志物（图9）。

图11 4号和6号患者肿瘤切片的H&E染色、TSK的空间得分及MMP10的空间表达

图12 4号患者肿瘤切片TSK的空间得分及TSK邻近基质细胞的signature得分

更进一步地，作者使用Visium空间基因表达试剂盒（10X Genomics）以更高的斑点分辨率和密度从另外两个患者肿瘤中获得了另外的8,885个捕获点的转录组。在这些样本中，作者也观察到了与之前类似的结果（图11，12），进一步验证了cSCC肿瘤边缘的异质性。

总的来说，这些数据确定了由TSK和基底肿瘤细胞以及TSK近端血管新生组成的异质cSCC肿瘤边缘。

3.cSCC的免疫状态分析

图13 scRNA-seq数据中免疫抑制相关基因表达的小提琴图

接下来，为探索不同细胞类型如何促进cSCC中的免疫活性，作者对scRNA-seq的结果进行了免疫抑制基因的表达分析，发现PD-L1和PD-L2仅在迁移的树突状细胞（DC）中表达，几种已知的T细胞抑制基因，包括VISTA，LGALS9和TNFRSF14得到广泛表达（图13）。

图14 免疫抑制基因的空间表达情况

ST结果显示，这些T细胞抑制基因在ST中表现出空间群特异性，与特定细胞类型的共定位一致，而髓样特异性因子则主要分布在炎症边缘（图14）。

图15 基于scRNA-seq结果的NK细胞和T细胞的基因表达热图

更进一步对NK细胞和T细胞各亚群的scRNA-seq结果进行基因表达分析发现，cSCC中耗竭性CD+4和CD8+T细胞亚群表达抑制性受体和疲劳标志物，如PD-1、CTLA4、LAG-3、TIGIT和HAVCR2，以及细胞毒性基因，如GZMA/B、GNLY和PRF1。同时，耗竭性CD4+T细胞表达滤泡辅助相关分子ICOS和CXCL13（图15）。

图16 患者2中按功能分组的特定基因的空间表达

从空间结果上看，T细胞转录本出现在炎症边缘和免疫相关亚群中（图16）。

图17 基于scRNA-seq数据的跨细胞类型的趋化因子基因表达热图和跨淋巴细胞类型的趋化因子受体基因的表达热图

接下来，作者通过分析scRNA-seq中的趋化因子和受体表达来评估肿瘤浸润淋巴细胞的潜在募集机制（图17）。几种趋化因子受体在重叠的T细胞亚群中高度表达，例如CXCR3（Treg，CD8+ TEM），CXCR6（Treg，CD4+ RGCC +和CD8+ 耗竭）和CXCR4（CD4+ RGCC+，CD8+ TEM，CD8+ TEMRA和NK细胞），表明它们被共招募。这与它们ST中的共定位结果相一致（图16）。

综上结果说明，cSCC免疫抑制机制涉及多种细胞类型，包括DC细胞、耗竭性T细胞和Treg。

4.MIBI解析炎性TME的单细胞空间结构

图18 患者肿瘤边缘的MIBI、基于MIBI的聚类和相关性分析

为进一步解析炎性TME的单细胞水平空间结构，作者在6位患者的肿瘤边缘的18个视野中使用了MIBI技术。通过该技术，作者共识别出55,832个细胞，并得到了在主要细胞类型上与sc-RNA-seq类似的聚类结果。同时，基于细胞类型丰度的相关性分析显示，CD8+T细胞、Treg、巨噬细胞和CD4+T细胞高度相关，而CD8+T细胞与Tregs的相关性最强（图18）。

图19 基于MIBI的共定位分析

图20 CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞与Treg的共定位分析

同时，作者还在5个视野中观察到了CD8+T细胞与Treg的共定位，并发现CD8+T细胞的比例与共定位呈正相关（图19），表明Treg可能同时受到与CD8+共招募至TME和共定位调控。CD4+T细胞和巨噬细胞也与Tregs大量相关，但与CD8+T细胞相比，它们在不同的视野中与Tregs共定位（图20）。

图21 MIBI视野下的肿瘤浸润情况

图22 基于MIBI的各类细胞的肿瘤浸润情况

此前有研究发现，肿瘤浸润或排斥是其免疫活性的另一个决定因素。本研究中，MIBI结果显示成纤维细胞，巨噬细胞和Treg在肿瘤-基质边界处最丰富，而CD8 T细胞和嗜中性白细胞在很大程度上被排除在肿瘤之外，这表明Treg的定位可能会阻止效应淋巴细胞进入肿瘤。同时，由于B细胞可介导免疫抑制或抗肿瘤活性，是唯一表现出优先浸润的细胞类型（图21，图22）。

这些结果揭示了cSCC的TME中各类细胞的定位模式，该模式可能代表了改善免疫控制的干预节点。

5.解析边缘处细胞间相互作用

图23 数据整合策略及TSK参与的细胞间相互作用

接下来，作者整合了scRNA-seq和ST数据以表征边缘处的肿瘤细胞与相邻TME细胞之间的相互作用。基于配体-受体对数据库，TSK参与了广泛的自分泌和旁分泌相互作用，包括与肿瘤相关成纤维细胞（CAF），内皮细胞，巨噬细胞和髓系抑制性细胞（MDSC）等的相互作用（图23）。

图24 TME中的各种配体和受体细胞的相关基因表达情况和配体-受体对

图25 TSK与CAFs相互作用的配体-受体对的空间表达

图26 TSK与CAFs、内皮相互作用的配体-受体对的空间表达

具体而言，CAFs与TSK间的相互作用由MMP9-LRP1、TNC-SDC1等几个TSK-CAF配体-受体对介导，TSK还可以通过PGF-FLT1、PGF-NRP2和EFNB1- EPHB4调节内皮细胞（图24，图25，图26）。

图27 TME中的各种配体和受体细胞的相关基因表达情况和配体-受体对

图28 巨噬细胞、CAFs与TSK相互作用的配体-受体对的空间表达

图29 内皮细胞、CAFs与TSK相互作用的配体-受体对的空间表达

相反，巨噬细胞、CAFs、内皮细胞高表达的配体，如SPP1、FN1和CTGF、THBS1和TFPI，与TSK受体ITGB1、ITGA1/3、TGFBR1和F3等匹配（图27，图28，图29）。这些结果进一步支持了支持TSK作为类EMT类群及其另一条与EMT和上皮肿瘤浸润相关的通路。

图30 实体瘤中TSK与TME中各类细胞的相关性

更进一步地，作者在癌症基因组图谱（TCGA）中检查了来自31种实体肿瘤类型的数千个肿瘤的转录组数据，发现各种肿瘤类型中TSK和CAF之间存在广泛相关性（图30）。

图31 Anti-PD-1治疗后的患者生存情况

同时，在PD-1检查点抑制剂治疗两种类型鳞状细胞癌的临床试验中，TSK特异性基因ITGB1和PLAU的高表达与无进展生存期明显减少相关（图31），证明了TSK细胞能够抑制抗肿瘤免疫。这表明，针对这一亚群或能改善免疫疗法。

图32 cSCC的异种移植实验结果

最后，为找出控制亚群特异性致瘤功能的关键基因，作者建立了异种移植模型。分析显示，异种移植实验重现了自发性人cSCC的亚群，并且人类和小鼠TME中的细胞类型对应物之间的共享标记高度重叠，异种移植中的几种髓样细胞类型之间仅存在细微差异。同时，体外细胞在基础、周期中和TSK评分中表现出的异质性较低，这符合肿瘤细胞群出现所需的TME（图32）。这些结果说明，异种移植模型涵盖了cSCC瘤内异质性的关键特征，可用于进一步分析。

图33 控制亚群特异性致瘤功能的关键基因网络

图34 TSK相关重要基因在TCGA中的作用评估和六种上皮癌的生存分析

于是，作者利用异种移植模型进行CRISPR/Cas9筛选，评估了肿瘤KC亚群在cSCC中的功能作用，得到了控制亚群特异性致瘤功能的关键基因调控网络（图33）。在此基础上，对TSK相关重要基因在TCGA中的作用的评估，作者发现FERMT1在许多亚型的癌症中都会被广泛扩增，提示其具有广泛的促肿瘤作用。此外，来自TCGA的具有高TSK基因表达的六种上皮癌的总体生存期较差有关，与该亚群在恶性行为中的作用一致（图34）。

研究意义：

该研究作者使用scRNA-seq、ST、多路离子束成像和异种移植等多种技术，对皮肤鳞状细胞癌进行了多角度高分辨率的整合分析，揭示了cSCC的空间异质性、抑制抗肿瘤免疫的重要细胞类群TSK和控制相关细胞类型定位和状态的细胞间信号和基因，为进一步的临床研究、免疫疗法的改善提供了依据。

参考文献：

Andrew L et al. Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma. Cell. VOLUME 182, ISSUE 2, P497-514.E22, JULY 23, 2020.

---

好消息~

百奥智汇目前已引进冷冻切片机、10x Visium平台等空间转录组相关实验设备，可进行包括大脑、皮肤、心脏、肾脏、乳腺、肺、胃、脾、淋巴结、脊髓、卵巢、大肠、小肠在内的30多种人、鼠、斑马鱼组织的空间转录组研究。

同时，百奥智汇的生信团队也对已发表的包括MIA、Giotto、SPOTlight等在内的各类空间分析算法、整合算法充分掌握，可根据用户需要进行定制化分析、应用最新算法，获得可发表的、最具说服力的结果。

   感兴趣者，可通过下方给出的联系方式联系我们。

长

按

关

注

百奥智汇科技有限公司

Analytical Biosciences Ltd.

微信号 : 百奥智汇+

网站：www.abiosciences.com
电话：[phone]

【点击阅读原文前往浏览】