iMeta｜湘雅医院刘庆组-泛癌分析揭示铜死亡调节子的临床和分子特征

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泛癌分析揭示铜死亡调节子的临床和分子特征

https://doi.org/10.1002/imt2.68

RESEARCH ARTICLE

●2022年12月5日，中南大学湘雅医院神经外科刘庆团队等在iMeta在线发表了题为“Pan-cancer analyses reveal molecular and clinical characteristics of cuproptosis regulators”的文章。

● 本研究开发了一个可以反映整体铜死亡水平的铜死亡活性评分模型，鉴定了各肿瘤类型中与铜死亡相关的miRNAs、lncRNAs以及转录因子，可为今后的铜死亡相关研究提供资源和参考。

●  第一作者：吴长武

●  通讯作者：刘庆 ([e-mail]) 

●  合作作者：谭军；王祥宇；秦超影；龙文勇；潘奕旻；李宇哲

●  主要单位：中南大学湘雅医院神经外科、德国海德堡大学神经外科实验部

亮   点

● 开发了一个可以反映整体铜死亡水平的铜死亡活性评分模型

● 铜死亡与多种肿瘤相关途径有关，特别是脂肪酸代谢水平高的肿瘤可能对铜死亡更敏感

● 铜死亡与肿瘤微环境的调控有关，可以根据铜死亡活性来预测接受免疫治疗的患者的预后

● 本研究鉴定了各肿瘤类型中与铜死亡相关的miRNAs、lncRNAs以及转录因子，为今后的铜死亡相关研究提供资源和参考

摘   要

铜稳态的失衡可能是致命的。最近的一项研究发现过量的铜诱导细胞死亡的方式依赖于线粒体压力，被称为“铜死亡”，这种细胞死亡方式在此前从未被描述过。铜死亡在肿瘤中的作用尚未被详细阐明。在这项研究中，我们通过对33种肿瘤类型的10000多个样本的多组学数据进行综合分析，揭示了铜死亡调节子和铜死亡活性在肿瘤中复杂而重要的作用。我们发现，CDKN2A是最常发生体细胞变异的铜死亡调节子，而且铜死亡调节子的表达在各种肿瘤中都有失调。此外，我们还开发了一个铜死亡活性评分以反映整体的铜死亡水平。根据铜死亡调节子的表达水平可以将肿瘤分为两个集群，它们具有不同的铜死亡活性和生存结果。重要的是，我们发现铜死亡活性与多种肿瘤的预后以及多种肿瘤相关途径有关，包括脂肪酸代谢和肿瘤微环境的重塑。此外，铜死亡增加了肿瘤对多种药物的敏感性，并表现出预测免疫疗法结果的潜力。我们还全面鉴定了与铜死亡有关的miRNAs、lncRNAs以及转录因子以促进未来的相关研究。我们在GitHub（https://github.com/Changwuuu/Cuproptosis-pancancer.git）中提供了与本研究结果对应的代码供读者参考。综上所述，本研究揭示了肿瘤中铜死亡调控子和铜死亡活性的重要分子和临床特征，并提出了将诱导铜死亡作为一种有前途的肿瘤治疗方法。本研究为今后的铜死亡相关研究提供了一个重要的参考依据。

视频解读

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全文解读

引  言

过渡金属在人体内复杂的生化反应中是必需的。铜是一种微量金属元素，对维持正常的细胞生物功能十分重要。铜还参与了与细胞命运密切相关的各种细胞过程，如氧化磷酸化、有氧呼吸、细胞生长和发育。保持铜平衡对人体至关重要，而铜平衡的微小变化即可造成不可逆的严重损害。由铜代谢失调引起的最具代表性的疾病是威尔逊病以及门克斯病。此外，铜在癌症中的作用也引起了研究者的极大关注。此前许多研究报道了癌症患者血清样本中铜的积累，包括乳腺癌、肺癌以及肝细胞癌。基于小鼠的肝细胞癌模型也显示肿瘤组织中的铜含量明显升高。虽然肿瘤中的铜积累是一种常见的趋势，但铜水平与癌症风险之间的关系尚不清楚。铜已被证明对肿瘤的增殖和血管生成很重要，这可能解释了为何铜在肿瘤组织区域富集。在癌细胞的细胞核区也可以观察到铜的积聚。铜螯合剂已被证明可以抑制肿瘤的生长和血管生成，例如，三戊胺可显著抑制人类肝癌细胞系的肿瘤发展。而四硫钼酸盐可抑制对BRAF或MEK1/2抑制剂耐药的黑色素瘤细胞系的生长。

另一方面，过量的铜对细胞是有害的，这解释了为什么可以使用铜离子载体来增加细胞内铜的含量从而诱导癌细胞凋亡。铜离子载体的抗癌作用已经在一些研究中得到证实。体外和体内实验都证实了双硫仑对炎性乳腺癌的抑制作用，双硫仑和二十二碳六烯酸的协同作用有效地抑制了肿瘤的生长，促进了癌细胞的凋亡。有学者认为，包括铜在内的金属离子的细胞毒性机制主要依赖于氧化应激。氧化应激是由活性氧（ROS）或剧毒的羟基自由基的水平增加引起的，超过了细胞的抗氧化能力。然而，最近发表在《科学》杂志上的一项研究挑战了这一传统观点。该研究显示，细胞内铜的积累可以通过脂酰化线粒体酶的聚集和Fe-S簇蛋白的丢失诱导一种新的调节性细胞死亡机制，被称为“铜死亡”。这种独特的细胞死亡类型不受ROS水平的影响并且不同于所有其他与氧化应激相关的细胞死亡机制。重要的是，还发现依赖半乳糖介导的线粒体呼吸的肿瘤细胞对铜死亡的敏感性比依赖葡萄糖诱导的糖酵解的细胞高近1000倍。鉴于糖酵解对肿瘤细胞的生长和代谢至关重要，抑制糖酵解不仅会抑制肿瘤的恶性发展，而且会增强对铜死亡的敏感性，这意味着肿瘤细胞中铜死亡的调节可能与其他治疗方式有协同作用，并有可能用于开发新的治疗策略。此外，为了确定参与铜死亡的基因，Tsvetkov等人进行了全基因组的CRISPR-Cas9功能缺失筛选，确定了10个可以调节铜死亡的基因。鉴于其对铜死亡活性的调控作用，我们将其称为铜死亡调节子。其中，有7个铜死亡调节子参与了铜死亡的正向调控，即铁氧还蛋白1（FDX1）, 硫辛酸合成酶（LIAS）, 脂质转移酶1（LIPT1），二氢脂酰胺脱氢酶（DLD），二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）,丙酮酸脱氢酶E1亚基α1（PDHA1）,以及丙酮酸脱氢酶E1亚基β（PDHB）。同时，其中三个被发现参与了铜死亡的负向调节，即金属调节转录因子1（MTF1），谷氨酰胺酶（GLS），以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）。这些铜死亡调节子的鉴定促进了对铜的毒性以及这种新型细胞死亡调节机制的探索。

新的细胞死亡机制往往会带来新的肿瘤治疗靶标，并促进个性化的治疗策略。例如，进行线粒体呼吸的细胞和具有高水平脂酰化蛋白的细胞对铜死亡高度敏感，表明铜离子载体疗法对具有这种代谢特征的肿瘤可能非常有效。可以想象，未来大量的研究将聚焦于在铜死亡对肿瘤发展的潜在影响，以及如何利用这种独特的死亡机制来改善癌症患者的预后，并促进生物医学发展。为了给未来的研究提供一个初步的概述和参考，我们利用大数据从多组学的角度全面评估了33种肿瘤中铜死亡调节子的分子和临床特征。图1是铜死亡的细胞模式图和本研究的工作流程。我们的研究表明，铜死亡与多种肿瘤的预后、癌症标志性途径的激活/抑制以及肿瘤微环境的调节密切相关。合理利用铜死亡在未来的癌症治疗中有着巨大的潜力。

图 1. 铜死亡的细胞模型图和本研究的工作流程

结   果

铜死亡调节子的体细胞变异景观

为了了解10个铜死亡调节子在肿瘤中的基因组改变，我们分析了10680个泛癌样本的单核苷酸变异（SNV）和拷贝数变异（CNV）数据，并描绘了SNV和CNV景观。总的来说，除了CDKN2A在14%的肿瘤中显示出CNV外，几乎所有的铜死亡调节子的CNV频率都很低（1%）（图2A）。CDKN2A的大多数CNV类型是深度缺失。此外，SNV图谱显示，所有铜死亡调节子的SNV频率都很低（0-2%），大多数铜死亡调节子的SNV类型以错义突变为主（图S1）。我们描述了33种肿瘤中每种肿瘤的铜死亡调节子的体细胞改变，以更好地了解不同肿瘤类型的情况。不同的肿瘤类型有不同的突变模式。所有10个铜死亡调节子在结肠腺癌（COAD）和子宫内膜癌（UCEC）中均出现突变现象，而在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、肾嫌色细胞瘤（KICH）、急性髓系白血病（LAML）、间皮瘤（MESO）、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、嗜铬细胞瘤及副神经节瘤（PCPG）、睾丸生殖细胞瘤（TGCT）、胸腺瘤和葡萄膜黑色素瘤（UVM）中没有观察到突变（图2B）。此外，CNKN2A的最高突变频率出现在头颈部鳞状细胞癌（HNSC）（10.1%）。对于CNV中的扩增现象，膀胱尿路上皮癌（BLCA）、肺腺癌（LUAD）、OV和UCEC中的所有铜死亡调节子都出现了扩增，而UVM中的所有铜死亡调节子都未发生改变（图2C）。食道癌（ESCA）中的DLD的扩增频率最高（8.2%）。在许多肿瘤类型中观察到高比例的CDKN2A深度缺失（图2D）。其中，超过一半的多形性胶质母细胞瘤样本显示CDKN2A深度缺失，而UVM只显示出FDX1（1.3%）和DLAT（1.3%）的低比例缺失。总的来说，铜死亡调节子在不同的肿瘤类型中表现出异质的体细胞变异模式。鉴于基因扩增和深度缺失在很大程度上介导了异常的基因表达，我们探讨了扩增和深度缺失对癌症中铜死亡调节子表达的影响。与预期一致，在所有10个铜死亡调节子中，出现扩增的样本的基因表达升高，出现深层缺失的样本的基因表达降低（图S2）。这表明，CNV会影响肿瘤中铜死亡调节子的表达水平。

图 2. 肿瘤中铜死亡调节子的体细胞变异

（A）肿瘤中铜死亡调节子的CNV景观。每行代表一个基因，每列代表一个病人。显示了10个铜死亡调节子的CNV频率。本图仅显示有铜死亡调节子CNV改变的患者。每个基因的变异率显示在右边的标签中。（B-D）在不同癌症类型中突变（B）、扩增（C）和深度缺失（D）的频率分布。图中的数字代表具体的变异率，颜色的强度与频率成正比

铜死亡调节子的基因表达模式

为了描述铜死亡调节子的基因表达模式，我们首先利用STRING数据库探讨了调节子之间的相互作用关系。如图S3所示，七个正向调节子和一个负向调节子（GLS）形成了一个相互作用网络，而MTF1和CDKN2A没有与其他调节子形成交互网络。我们进一步探讨了调节子在不同正常组织中的表达分布。总的来说，调节子的表达在不同组织中均匀分布，其中FDX1在肾上腺中表达最高，CDKN2A在骨髓中表达则极低（图S4）。

成对的正常-肿瘤组织的差异表达分析显示铜死亡调节子在17种肿瘤中出现异常表达（图3A）。FDX1在12种肿瘤中表达下调，LIPT1在8种肿瘤中表达下调，CDKN2A在16种肿瘤中表达明显上调。其他调节子显示出异质性的表达模式。例如，LIAS的表达在大多数肿瘤中是下调的，但在KICH和LUAD中其表达是上调的。随后，我们探讨了这些调节子在33种肿瘤中的共表达关系。表S1显示了在所有肿瘤类型中所有调节子之间普遍存在的表达相关性。在大多数肿瘤中，FDX1的表达与其他六个正向调节子的表达水平显著正相关。这表明，肿瘤中的铜死亡调节子可能共同调节铜死亡活性。

为了更好地了解肿瘤中铜死亡调节子的表达情况，我们对33种肿瘤类型的所有样本进行了基于调节子mRNA表达的无监督共识聚类。根据共识累积分布函数和delta面积，所有的肿瘤被明显地分为两个不同的样本集群（图3B）。与集群2相比，集群1具有较高的FDX1、LIAS、LIPT1、DLD、DLAT、PDHB和GLS表达，而CDKN2A的表达明显较低（图3C）。检查所有癌症类型在两个集群中的分布，发现所有的LAML、大多数COAD、肾癌（KICH、肾透明细胞癌[KIRC]和肾乳头状细胞癌[KIRP]）、前列腺癌（PRAD）、直肠腺癌、TGCT和甲状腺癌（THCA）分布在集群1，而三种妇科肿瘤（宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌 [CESC]、OV和子宫肉瘤）大多分布在集群2（图3D）。由于肿瘤中的铜死亡受到10个调节子的调节，任何一个单独的调节子的表达都难以反映铜死亡的整体水平。因此，我们首次根据铜死亡正负向调节子的mRNA表达水平提出了铜死亡正向评分、铜死亡负向评分和铜死亡活性评分。在泛癌背景下，铜死亡正向评分与所有正向调节子的表达呈正相关，铜死亡负向评分与所有负向调节子的表达呈正相关（图S5）。铜死亡活性评分与铜死亡正向评分以及正向调节子的表达呈正相关，与铜死亡负向评分以及负向调节子的表达呈负相关。铜死亡活性评分综合了所有调节子的表达丰度，更好地反映了整体铜死亡水平。随后，我们发现集群1的铜死亡正向和活性评分明显高于集群2，而负向评分则低于集群2（图3E），这表明集群1的铜死亡水平相对较高。生存分析显示，集群1的总体预后明显好于集群2（图3F），这意味着铜死亡水平可能影响肿瘤患者的生存。

为了确定潜在的铜死亡表型相关基因，我们进行了基于铜死亡活性的相关性分析。共确定了1079个铜死亡表型相关基因（表S2）。通过基因本体论（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析，我们发现铜死亡表型相关基因主要参与能量代谢相关的生物过程，如有氧呼吸、线粒体呼吸、氧化磷酸化、三羧酸（TCA）循环等途径（图S6），这与Tsvetkov等人的研究一致。

图 3.  肿瘤中铜死亡调节子的基因表达模式

（A）肿瘤样本和正常样本之间铜死亡调节子的mRNA差异。红色表示在肿瘤中高表达，蓝色表示低表达。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001。（B）铜死亡调节子mRNA表达的无监督共识聚类显示了两个不同的集群。每一行代表一个铜死亡调节子，每一列是一个病人。红色表示高表达，蓝色表示低表达。（C）箱式图显示了两个集群中10个铜死亡调节子的表达差异。**** p < 0.0001。（D）两个集群在肿瘤中的分布。每一行代表一种癌症类型，每一列代表一个集群。每个框中的数字和颜色强度显示了归入相应集群的样本所占百分比。（E）箱式图显示了两个集群中铜死亡正向分数、铜死亡负向分数和铜死亡活性分数的差异。**** p < 0.0001。（F）Kaplan-Meier曲线显示集群1和集群2之间的总体生存差异。集群1用蓝线表示，集群2用红线表示

铜死亡调节子的甲基化分析

基因启动子区域的甲基化在很大程度上调节着基因的表达，而高甲基化一般会抑制基因的表达。然而，在一些特殊情况下，启动子区域的高甲基化可能会增强某基因的表达，如hTERT。为了探索铜死亡调节子的甲基化改变，我们首先比较了配对的正常组织和肿瘤组织之间调节子的甲基化差异。如图4A所示，所有16种肿瘤中都有调节子的甲基化水平发生改变且调节子的甲基化改变在不同的肿瘤类型中是异质的。例如，与配对的正常组织相比，FDX1的甲基化水平在BLCA、BRCA、COAD、HNSC、KIRP和UCEC肿瘤组织中升高，而在KIRC中则降低。值得注意的是，MTF1在任何一种肿瘤类型中都没有显示甲基化水平的改变。此外，我们分析了33种肿瘤类型中调节子甲基化水平和mRNA表达水平之间的相关性。在大多数肿瘤类型中，FDX1、DLAT、GLS和CDKN2A的启动子甲基化水平与mRNA表达水平呈负相关（图4B）。在特定的肿瘤类型中，LIAS、DLD、PDHA1、PDHB和MTF1的甲基化水平与mRNA表达水平呈负相关或正相关。例如，MTF1的甲基化水平与mRNA表达在BRCA、CESC、DLBC和较低级别胶质瘤（LGG）中呈负相关，在THCA中呈正相关（图4B）。值得注意的是，在大多数肿瘤类型中，LIPT1的甲基化水平与mRNA表达水平呈正相关。生存分析显示，在17种肿瘤类型中，铜死亡调节子的甲基化水平与总生存期（OS）相关，并且这种相关关系取决于肿瘤类型（图4C）。例如，FDX1高甲基化与LGG的不良OS有关，而与UVM的良好OS有关（图4D，E）。

图 4.  肿瘤中铜死亡调节子的甲基化

（A） 肿瘤样本和正常样本之间的铜死亡调节子甲基化差异。红色表示肿瘤中甲基化程度增加，蓝色表示甲基化程度降低。* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 （B）甲基化和mRNA表达之间的相关性。蓝点代表负相关，红点代表正相关，颜色越深，相关度越高。（C） 肿瘤中铜死亡调节子甲基化与生存的关系。红点表示高甲基化与生存率下降有关，蓝点表示高甲基化与生存率提高有关。点的大小代表统计学意义，点越大，统计学显著性越高。仅显示了有统计学意义的肿瘤类型。（D, E）Kaplan-Meier曲线显示FDX1高甲基化组和FDX1低甲基化组在LGG（D）和UVM（E）中的OS差异。高甲基化组用红线表示，低甲基化组用蓝色表示

微小RNA（miRNA）、长非编码RNA（lncRNA）和转录因子（TF）调控铜死亡调节子的表达水平

在本研究之前的结果中，我们描述了CNV和DNA甲基化对铜死亡调节子表达的调控。miRNA可以作为基因表达抑制因子，通过靶向mRNA的3'端非翻译区来调节基因转录后表达。为了全面探索可能调控铜死亡调节子的miRNA，我们筛选了所有可以针对这些调节子3'端非翻译区的miRNA。在表S3中，我们列出了所有潜在的miRNA-mRNA对，它们可能在不同肿瘤类型中靶向不同的铜死亡调节子，为未来铜死亡相关的miRNA研究提供了参考。值得注意的是，174个miRNA-mRNA对中囊括了127个不同的miRNA，这些miRNA-mRNA对至少在五种肿瘤类型中存在。有趣的是，127个miRNA中的33个至少靶向两个铜死亡调节子，构成了一个miRNA调控网络（图5A）。鉴于这些miRNA在多种肿瘤中靶向了多个调节子，它们可能是潜在的可以调控铜死亡调节子的miRNA。

LncRNA是基因表达的重要调节因子，在转录、翻译和翻译后修饰中发挥重要作用。因此，我们将一项关于lncRNA的泛癌分析与基因表达相关性分析的数据相结合，筛选出潜在的调控不同肿瘤类型的铜死亡的lncRNA-mRNA对（表S4）。共确定了168个lncRNA-mRNA对，涉及72个lncRNA，其中24个靶向至少三个铜死亡调节子，构成了一个lncRNA调控网络（图5B）。

TF是基因转录和表达的关键调控因子，失调的TF介导了异常的基因表达，代表了一类独特的药物靶点。我们分析了以前的泛癌研究中列出的一系列TF，共发现共有429个TF-mRNA对，包含196个不同的TF，其中20个TF至少靶向了5个铜死亡调节子（图5C）。重要的是，核因子I C ( NFIC )靶向了九个铜死亡调节子，表明它可能是介导肿瘤中铜死亡的一个关键TF。表S5列出了在不同肿瘤类型中可能靶向铜死亡调节子的所有TF-mRNA对。

图 5.  miRNA、lncRNA和TF调控网络

（A）miRNA-mRNA调控网络显示了至少靶向两个铜死亡调节子的miRNA。（B）lncRNA-mRNA调控网络显示了至少靶向三个铜死亡调节子的lncRNA。（C）TF-mRNA调控网络显示了至少靶向五个铜死亡调节子的TF

铜死亡活性可以预测癌症患者的预后

这项研究先前的结果表明在泛癌症的背景下铜死亡活性可以预测OS。为了进一步阐明铜死亡对患者生存的影响，我们探讨了铜死亡调节子和铜死亡评分对不同肿瘤类型的预后预测作用。我们对铜死亡调节子或评分进行Cox回归分析并计算生存风险，根据铜死亡调节子或评分的中位数将不同类型的肿瘤分为两组后，用log-rank检验来确定其显著性。如图6A所示，铜死亡调节子和评分在不同的肿瘤类型中具有不同的预后作用。在肾上腺皮质癌（ACC）、COAD、KIRC、KIRP、LGG、肝细胞癌（LIHC）和MESO中，LIAS的高表达与较好的OS相关，而在ACC、COAD、KIRC、LIHC、PCPG、PRAD、UCEC和UVM中，CDKN2A的高表达与不良OS相关。此外，在HNSC中，铜死亡活性评分升高与较差的OS相关，而在KIRP、LIHC和UCEC患者中与较好的OS相关。图6B和6C显示了根据HNSC和UCEC的中位值分别将样本分为两组后，高和低铜死亡活性评分组之间的Kaplan-Meier生存曲线。为了进一步证实铜死亡对患者OS的影响，我们根据铜死亡活性评分的最佳截止值将患者分为两组后，进行了Kaplan-Meier生存曲线分析。结果显示，在33种肿瘤类型中，有13种肿瘤的铜死亡活性与OS明显相关（图S7）。其中，在COAD、DLBC、KIRP、LAML、LGG、LIHC、 肺鳞状细胞癌 （LUSC）、肉瘤和UCEC中，较高的铜死亡活性预示着较好的OS，在HNSC、LUAD、皮肤黑色素瘤和UVM中则预示着较差的OS。除OS外，我们还分析了铜死亡与无病生存期（DFI）和无进展生存期（PFI）之间的关系。我们发现，铜死亡调节子表达水平和活性评分与16种肿瘤的DFI和20种肿瘤的PFI密切相关，相关性取决于肿瘤类型（图6D，E）。此外，我们利用中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）中的LGG队列进行了外部验证。如图6F所示，Cox回归分析显示，FDX1、MTF1和铜死亡负向评分与LGG较差的OS相关，而LIAS和铜死亡活性评分与较好的OS相关。Kaplan-Meier曲线进一步验证了铜死亡评分在LGG的预后价值（图6G），这与癌症基因组图谱（TCGA）数据库的结果一致。这些结果表明，铜死亡与特定肿瘤类型的预后相关，可以预测患者的生存。

图6. 铜死亡调节子的预后价值

铜死亡调节子和铜死亡评分的OS（A）、DFI（D）和PFI（E）分析。点的大小代表铜死亡调节子或评分对每种癌症类型的预后价值的显著性。仅显示有统计学意义的肿瘤类型。红点表示高基因表达或高评分与更差的预后有关，蓝点表示高基因表达或高评分与更好的预后有关。（B, C）Kaplan-Meier曲线显示了HNSC（B）和UCEC（C）中高铜死亡活性和低铜死亡活性组的OS差异。红线表示高铜死亡活性组，蓝线表示低铜死亡活性组。（F）CGGA-LGG队列中铜死亡调节子和铜死亡评分的OS分析。P值和危险比是通过Cox回归分析计算的。红点表示高基因表达或高评分与更差的OS有关，绿点表示高基因表达或高评分与更好的OS有关。（G）Kaplan-Meier曲线显示了CGGA-LGG队列中高铜死亡活性/高负向评分组和低铜死亡活性/低负向评分组的OS差异

铜死亡的通路活性分析

我们已有的研究结果证明了铜死亡在肿瘤中的失调和预后作用；然而，铜死亡参与的具体肿瘤相关途径仍然未知。因此，我们首先推断了33种肿瘤中50个癌症标志基因集的富集水平（表S6），这全面反映了与肿瘤相关的生物学过程。随后，我们计算了每个肿瘤类型中铜死亡活性评分与所有标志基因集富集水平的相关性，并可视化为热图（图7A；表S7）。在大多数肿瘤类型中，铜死亡活性与大约一半的肿瘤标志基因集呈正相关，与另一半的标志基因集呈负相关，表明铜死亡在肿瘤中起着关键作用（图7A）。值得注意的是，在所有33种肿瘤类型中，铜死亡活性与氧化磷酸化明显正相关（图7B），这与Tsvetkov等人的研究一致，即铜死亡依赖于线粒体呼吸和TCA循环，进一步表明铜死亡活性得分可以反映铜死亡水平。此外，在24种肿瘤类型中，铜死亡也与缺氧明显负相关（图7B），Tsvetkov等人发现，缺氧（1% O2）通过迫使细胞依赖糖酵解而不是氧化磷酸化来降低铜死亡敏感性。在所有的肿瘤类型中，铜死亡也与脂肪酸的代谢明显正相关（图7B）。此外，在超过25种癌症类型中，铜死亡与顶端连接、有丝分裂纺锤体、EMT、TGF-β、KRAS和肿瘤坏死因子-α信号途径呈负相关，证实了铜死亡在肿瘤转移和生长中的重要调节作用。引人注目的是，在大多数肿瘤类型中，铜死亡与多种免疫相关途径呈负相关，包括炎症反应、补体、IL-6/JAK/STAT3通路，以及干扰素γ反应途径（图7B）。鉴于铜死亡与27种肿瘤类型的DNA修复呈正相关，我们进一步探讨了铜死亡是否与基因组不稳定性有关。与预期一致，在11种肿瘤类型中，铜死亡与同源重组缺陷（HRD）相关的指标呈负相关，但只有三种肿瘤类型与突变负担呈负相关（图S8）。此外，由于CDKN2A是一个总所周知的细胞衰老和细胞周期标志物，我们进一步探讨了铜死亡死亡与其他细胞衰老和周期标志物的关系。如图S9A所示，在几乎所有的肿瘤类型中，铜死亡与大多数细胞衰老标志物呈负相关。对于细胞周期标志物，在几乎所有的肿瘤类型中，包括CDK7在内的15个标志物与铜死亡正相关，而其他大多数细胞周期标志物与肿瘤中的铜死亡主要是负相关（图S9B）。在包括UVM在内的七种肿瘤类型中，铜死亡与大多数细胞周期标志物呈正相关。综上所述，上述结果表明，铜死亡参与了肿瘤的多种生物学过程。

图7. 铜死亡相关的肿瘤标志通路

（A）热图显示了每种癌症类型中铜死亡活性和肿瘤标志通路活性之间的相关性。每一列是一个癌症类型，每一行是一个标志通路。红色代表正相关，蓝色代表负相关。（B）条形图显示铜死亡活性和肿瘤标志通路之间具有负（蓝色）和正（红色）相关性的癌症类型的数量

铜死亡相关的免疫特征

在通路活性分析中，我们观察到铜死亡和免疫相关途径之间存在明显的相关性。为了更好地揭示铜死亡和肿瘤免疫之间的内在联系，我们首先推断了所有肿瘤样本的整体免疫（ImmuneScore）和基质（StromalScore）浸润水平（表S8）。与通路活性分析的结果一致，在大多数类型的肿瘤中，铜死亡与整体免疫和基质细胞浸润水平明显负相关（图8A）。此外，铜死亡与肿瘤的ESTIMATEScore呈负相关，表明铜死亡与肿瘤的纯度呈正相关。为了进一步了解铜死亡与不同类型的免疫细胞的丰度之间的相关性，我们从以前的泛癌分析中收集了所有肿瘤样本中22种免疫细胞的浸润水平数据。我们计算了铜死亡与每种肿瘤类型的免疫细胞浸润水平之间的相关性（表S9）。如图8B所示，铜死亡和肿瘤浸润免疫细胞之间存在异质的相关性。在11种肿瘤类型中，铜死亡与M1巨噬细胞的丰度呈负相关，而在10种肿瘤类型中，铜死亡与滤泡辅助T细胞的丰度呈正相关（图8C）。总的来说，铜死亡与众多免疫细胞的丰度相关，而这种相关性可能因肿瘤类型而异。免疫调节剂对免疫治疗的反应至关重要，我们从Zeng等人以前的研究中收集了一些经典的免疫激活相关基因、免疫检查点相关基因和TGF-β/EMT途径相关基因，然后我们计算了铜死亡与这些免疫调节子之间的相关性（表S10）。一般来说，在大多数肿瘤类型中，铜死亡与大多数免疫调节子呈负相关，这与前面的研究结果一致（图8D）。尽管在一些特定的肿瘤类型中，如多形性胶质母细胞瘤，免疫激活相关基因似乎与铜死亡呈正相关，但这种相关性并不显著。Thorsson等人将33种肿瘤类型的所有样本分为六种免疫亚型（C1-C6），在泛癌背景下具有不同的免疫特征，并得到广泛认可。因此，我们比较了这六种免疫亚型之间的铜死亡的差异。如图8E所示，C4（淋巴细胞耗尽）肿瘤的铜死亡活性最高，而C6（TGF-β为主）肿瘤的铜死亡活性最低。这进一步验证了铜死亡与TGF-β途径之间的负相关关系。基于这一结果，我们可以假设，高铜死亡肿瘤中较低的免疫反应可能与淋巴细胞耗竭有关。这些结果意味着铜死亡和肿瘤免疫之间存在广泛的联系。

图 8. 铜死亡与肿瘤免疫特征相关

（A）铜死亡活性与ImmuneScore，StromalScore以及ESTIMATEScore之间的相关性。蓝点代表负相关，颜色越深，相关度越高。（B）热图显示了铜死亡活性与每种癌症类型中22种免疫细胞的丰度之间的相关性。每一列是一个癌症类型，每一行是一种免疫细胞。红色代表正相关，蓝色代表负相关。（C）条形图显示铜死亡活性和22个免疫细胞之间有负（蓝色）和正（红色）相关性的癌症类型的数量。（D）热图显示每个癌症类型中铜死亡活性和免疫调节子的表达之间的相关性。每一列是一种癌症类型，每一行是一种免疫调节子。红色代表正相关，蓝色代表负相关。（E）箱式图表示免疫亚型（C1-C6）之间铜死亡活性的差异。每两种免疫亚型之间的p值均小于0.001

铜死亡与药物敏感性以及免疫治疗结果的关系

在建立了铜死亡与众多癌症标志途径以及免疫相关特征的关联后，我们希望了解铜死亡是否能影响患者对化疗、靶向治疗和免疫治疗的反应。我们整合了癌症药物敏感性基因组学（GDSC）数据库中肿瘤细胞系的基因表达数据和药物敏感性数据，并分析了铜死亡与198种药物的半数最大抑制浓度（IC50）的相关性。我们观察到铜死亡与39种药物的IC50之间存在明显的负相关关系，但未能观察到铜死亡与任何药物的IC50之间存在正相关关系（图9A）。通过研究这39种药物的作用机制，发现一些药物所靶向途径在之前的结果中已被证明与铜死亡活性呈负相关。例如，在13种肿瘤类型中，通路活性分析发现铜死亡与P53以及PI3K/MTOR通路呈负相关，与之对应的是铜死亡与两个P53通路抑制剂（MIRA-1和Nutlin-3a（-））以及三个PI3K/MTOR通路抑制剂（Ipatasertib、LJI308和Uprosertib）的敏感性增加有关（图9A），这进一步加强了我们研究的可靠性。此外，我们估计了ACC中单个肿瘤样本的药物敏感性，并探讨了这些样本的IC50 和铜死亡之间的关系。与之前的结果一致，在ACC中，铜死亡与四个PI3K/MTOR通路抑制剂（Afuresertib、Ipatasertib、OSI-027和Uprosertib）以及一个P53通路抑制剂（Nutlin-3a（-））的敏感性增加相关（表S11）。有趣的是，我们还发现，铜死亡与ACC中29种药物的耐药性增加有关，涉及多种机制，比如DNA复制。

免疫检查点抑制剂（ICI）治疗是目前最成功和最常见的免疫治疗方法。为了进一步研究铜死亡是否影响肿瘤患者的ICI治疗结果，我们从以前的研究中收集了一个接受抗程序性死亡配体-1（PD-L1）治疗的转移性尿道癌队列（IMvigor210）和一个接受抗程序性死亡-1（PD-1）治疗的转移性黑色素瘤队列（GSE78220）。在IMvigor210队列中，我们发现铜死亡与肿瘤的ImmuneScore、StromalScore和ESIMATEScore呈负相关（图9B）。更重要的是，在这个队列中，铜死亡与PD-L1表达呈负相关（图9C）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，在抗PD-L1治疗后，高铜死亡活性的患者比低铜死亡活性的患者生存期更长（图9D）。在GSE78220队列中，虽然铜死亡与PD-1的表达不相关（图9E），但Kaplan-Meier生存曲线分析表明，铜死亡活性高的患者在抗PD-1治疗后的OS比铜死亡活性低的患者要好（图9F）。这些结果为铜死亡在ICI免疫疗法中的预测作用提供了初步证据。

图 9. 铜死亡与药物敏感性以及免疫治疗结果之间的关系

（A）铜死亡活性与药物敏感性（IC50值）之间的相关性。每一行代表一种药物和药物靶标。线的长度代表相关系数。蓝色代表负相关，即高铜死亡活性与较高的药物敏感性相关。点的大小代表统计学意义，点越大，统计学显著性越高。（B）IMvigor210队列中铜死亡活性与ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore的相关性。（C）IMvigor210队列中铜死亡活性与PD-L1表达的相关性。（D）Kaplan-Meier曲线显示了IMvigor210队列中抗PD-L1免疫治疗后高和低铜死亡活性组之间的OS差异。（E）GSE78220队列中铜死亡活性与PD-1表达的相关性。（F）Kaplan-Meier曲线显示了GSE78220队列中抗PD-1免疫治疗后高和低铜死亡活性组之间的OS差异

讨  论

铜是一把双刃剑，其平衡失调会严重危及人类的生命。铜螯合剂和铜离子载体都是很有前途的抗癌剂。以前的研究表明，铜超载的毒性机制依赖于氧化应激。然而，Tsvetkov等人首次揭示了铜死亡，这是一种全新的细胞死亡形式，与之前已知的调节性细胞死亡不同，并鉴定了铜死亡的10个调节子。与依赖氧化应激的调节性细胞死亡（如细胞凋亡和铁死亡）方式不同，铜死亡依赖于线粒体应激，并由铜与TCA循环的脂酰化成分结合所诱导。作为一种全新的、完全不同的、以前从未被描述过的细胞死亡形式，基于铜死亡的肿瘤研究有望蓬勃发展。因此，对铜死亡在肿瘤中的作用的初步研究是必要的，可以进一步了解肿瘤的发展机制和探索新的临床治疗方法。本研究通过对TCGA的33种肿瘤类型的10000多个样本的多组学数据进行挖掘和分析，对铜死亡的特征进行了全面且综合的表征。

遗传变异分析显示，大多数铜死亡调节子在肿瘤中的体细胞变异比例较低；然而，CDKN2A在多种肿瘤中发生了广泛的体细胞变异。这与目前已有的知识一致，即CDKN2A参与细胞生长和周期调节，其突变和丢失是许多肿瘤的重要事件，并导致多种肿瘤发生。然而，我们发现，在16种肿瘤类型中，作为肿瘤抑制因子的CDKN2A的mRNA表达明显上调。尽管CDKN2A的缺失可以减少其表达，但CDKN2A在BRCA、ESCA、HNSC、LIHC和LUSC中显示出低甲基化，这表明CDKN2A在这些肿瘤中的上调可能主要是由低甲基化调节的。有趣的是，CDKN2A在KIRP和THCA中的表达和甲基化水平都升高了，然而CDKN2A在这两种肿瘤中的高甲基化却上调了基因表达，这表明KIRP和THCA中CDKN2A的高表达也受到高甲基化的调节。这一反常现象表明CDKN2A的甲基化对基因表达的调节依赖于肿瘤类型，值得进一步研究。对于一些特定的肿瘤，如LUSC，尽管存在大量的深度缺失和高甲基化，但CDKN2A的表达却明显升高，说明CDKN2A的表达在这些肿瘤中主要受其他机制的影响，如miRNA、lncRNA和TF。此外，尽管CDKN2A的突变和缺失的致癌作用已被证实, 但令人意外的是，在各种肿瘤中CDKN2A高表达预示着预后不良。虽然以前的研究也表明CDKN2A的高表达与LIHC、COAD和BLCA的预后不佳有关，然而，CDKN2A作为肿瘤抑制因子却导致预后不良的机制还没有得到澄清。Shi等人推测，这可能与CDKN2A参与EMT过程有关。CDKN2A作为铜死亡的负调控子的作用以前从未被描述过，考虑到在本研究中高铜死亡活性被发现是多种肿瘤（包括COAD和LIHC）的有利预后因素，我们有理由认为CDKN2A可能通过负调控铜死亡活性而导致这些肿瘤的不良预后。这值得在未来进行深入研究，以开发合适的靶向药物。此外，在多种肿瘤类型中，CDKN2A的表达与铜死亡正向调节子（包括FDX1和LIPT1）的表达呈负相关。我们认为，CDKN2A的表达也可能受到其他铜死亡调节子的影响。因此，同时靶向包括CDKN2A在内的多个调节子可能能够产生协同效应，这需要广泛的基础和临床研究来验证。

FDX1是铜死亡最重要的正向调节因子，其高表达只与COAD和LIHC的较好预后有关，这可能是由于FDX1对铜死亡活性的上调。然而，FDX1与大多数肿瘤类型的预后不相关，这与Zhang等人的研究一致，他们也表明FDX1不能影响LUAD细胞的增殖和凋亡。考虑到铜死亡活性对许多肿瘤类型的预后的影响，有必要将所有铜死亡调节子作为一个整体来考虑，因此，我们开发了铜死亡活性评分。相关性分析和通路活性分析充分证明了铜死亡活性评分可以反映整体铜死亡水平，这为今后的铜死亡研究提供了参考方法。

miRNA、lncRNA和TF对基因表达的调控作用是众所周知的，毫无疑问，一定存在一些miRNA、lncRNA和TF可以间接调控铜死亡。为了给进一步的相关研究铺平道路，我们鉴定了潜在的与铜死亡相关的miRNA、lncRNA和TF，并构建了调控网络。在所鉴定的miRNA中，有些已经在以前的研究中得到证实，如miR-10b在胶质瘤中可以靶向CDKN2A，这进一步支持了我们研究的可靠性。有趣且重要的是，我们发现的潜在miRNA-mRNA对和lncRNA-mRNA对之间存在一些相互作用。例如，本研究中的lncRNA MEG3和miR-204都可以靶向CDKN2A，而在以前的研究中发现MEG3通过MEG3/miR-204/CDKN2A调控轴来调节巨噬细胞的炎症和凋亡。这表明，本研究中发现的lncRNA也可能通过miRNA以竞争内源性RNA的机制调节铜死亡调节子的表达。因此，将我们鉴定的lncRNA和miRNA结合起来进行进一步研究似乎是可行的，也是有希望的。值得一提的是，TF NFIC在调控网络中靶向9个铜死亡调节子，这意味着NFIC可能是铜死亡的一个关键上游TF。NFIC在调节多种肿瘤的生长和转移中的作用已经得到证实，其机制涉及EMT过程和NF-κB途径。然而，NFIC与铜死亡的关联性从未被表征，因此，我们假设NFIC也可以通过调节铜死亡影响肿瘤的发展，这值得进一步探讨。

在通路活性分析中，我们注意到铜死亡、氧化磷酸化和缺氧之间有很强的相关性，这符合Tsvetkov等人详细阐明的铜死亡发生机制。此外，我们发现铜死亡与多个肿瘤相关通路之间存在负相关，这直接为我们在药物敏感性分析中的发现提供了理论依据。在我们的研究结果中，高铜死亡活性与多种药物的高敏感性有关，这意味着铜离子载体有可能作为抗肿瘤药物与多种药物发生协同作用。这一发现在以前的实验中得到了验证。例如，药物敏感性分析显示，铜离子载体增加了三种PI3K抑制剂的敏感性，而在Zhang等人的研究中，在体内和体外实验中，铜离子载体双硫仑与PI3K抑制剂的组合明显抑制了乳腺癌的生长。除了与肿瘤相关途径有关外，另一个值得关注的发现是，在所有的肿瘤类型中，铜死亡与脂肪酸代谢呈正相关。Tsvetkov等人只报告了铜死亡在依赖线粒体呼吸（氧化磷酸化）的细胞中更敏感，但没有提及脂肪酸代谢。脂肪酸代谢是癌细胞代谢的一个重要组成部分。在脂肪酸代谢中，β-氧化作用将脂肪酸的长碳链分解为乙酰-CoA，然后将其送入TCA循环，这些过程发生在线粒体中。鉴于铜死亡依赖于线粒体的压力和铜与TCA循环的脂酰化成分的结合，结合我们的结果，我们有理由相信具有高脂肪酸代谢的肿瘤对铜死亡同样敏感。这可能有助于开发个性化的铜死亡疗法。

引人注目的是，本研究显示，在大多数肿瘤中铜死亡与免疫相关途径之间有很强的相关性，这表明铜死亡可能参与了肿瘤微环境的重塑。高铜死亡活性往往意味着较低的免疫反应和免疫细胞浸润。由于现有的研究表明，氧化磷酸化和TCA循环代谢在免疫细胞的激活和代谢中也是至关重要的，我们认为免疫细胞可能对铜死亡同样敏感。以前的研究表明，预先存在的抗肿瘤免疫力往往与更好的预后有关。然而，在我们的研究中，尽管高铜死亡活性降低了免疫反应，但它仍然改善了各种肿瘤的预后。这似乎是矛盾的，但众多的研究也表明，即使有着大量的免疫成分也不意味着更好的预后。这与各种因素有关，如肿瘤本身的侵略性、肿瘤微环境的组成、免疫刺激和抑制因素的相对优势等。因此，高铜死亡肿瘤的预后较好可能与低基质浸润和低免疫抑制有关。这也可能是免疫治疗队列中高铜死亡患者预后更好的原因之一。在免疫治疗队列中，虽然铜死亡活性与免疫浸润和PD-(L)1表达呈负相关或不相关，但高铜死亡的患者仍有良好的预后，这可能是由于基质浸润较低。事实上，在最近的研究中，PD-(L)1的表达并不能作为ICI治疗反应的良好预测指标。此外，基于临床试验的研究表明，TGF-β通过排除T细胞从而削弱了肿瘤对抗PD-L1治疗的反应。本研究显示，在高铜死亡活性的患者中，低TGF-β信号传导可能是高铜死亡活性患者在ICI治疗中获得积极结果的原因。然而，铜死亡在免疫治疗中的具体作用和机制还需要在未来的基础和临床研究中加以阐明。同样，本研究的主要局限性在于目前的结果是基于大数据的综合分析，因此需要大量的实验来验证现有的结果和揭示潜在的机制。

结   论

本研究全面考察了33种肿瘤的铜死亡调节子和铜死亡活性的临床和分子特征，为今后铜死亡相关研究提供了宝贵的资源和参考依据。我们发现铜死亡与多种肿瘤的预后有关。此外，铜死亡与TGF-β/EMT在内的多种肿瘤相关通路以及炎症反应呈负相关，并表现出预测免疫疗法结果的潜力。铜死亡可被用于开发治疗癌症的新策略。

方   法

SNV和CNV分析

TCGA数据库的33种肿瘤类型的SNV和CNV数据从Xena Functional Genomics Explorer（https://xenabrowser.net/datapages/）获得。每个肿瘤类型的样本量汇总于表S12中。SNV数据在本研究中只保留了非沉默性突变，包括Missense_Mutation、Nonsense_Mutation、Frame_Shift_Del、Splice_Site、Frame_Shift_Ins、In_Frame_Del和Nonstop_Mutation。根据以前的研究，CNV数据中等于2的值被认为是扩增，等于-2的值被认为是深度缺失。每个肿瘤类型的每个调节子的SNV和CNV比值都被计算出来。此外，OncoPrint图中的整体体细胞改变景观是用R软件包 "ComplexHeatmap "生成的。

mRNA表达分析以及铜死亡评分

从Xena获得了基因型-组织表达数据集的正常组织基因表达数据以比较健康人的不同正常组织中铜死亡调节子的表达差异。此外，还从Xena获得了TCGA数据集中 11060 个肿瘤患者样本的基因表达数据。这个数据集是由TCGA PanCan Atlas项目生成的，基因表达数据已经针对批次效应进行了归一化处理，表达数据进行了log2（x+1）转换。使用STRING数据库（https://string-db.org/）构建了铜死亡调节子之间的相互作用网络。在33种肿瘤类型中，只有17种含有5对以上肿瘤和正常组织样本的肿瘤类型被纳入肿瘤和正常组织之间的差异表达分析。差异倍数变化的计算方法是根据肿瘤样本表达量的平均值与正常样本表达量的平均值的比值，p值使用t检验计算。根据铜死亡调节子的mRNA表达水平，通过基于PAM算法的无监督共识聚类确定潜在的铜死亡相关集群。共进行了1000次运算，每次运算包括80%的患者，聚类的数量设置为2-10个。共识累积分布函数和delta面积被用来定义最佳的聚类数量。

为了了解每个样本的整体铜死亡水平，我们使用了以前所报道的方法。我们通过GSVA 算法计算铜死亡的正向和负向调节子的基因集富集分数，分别定义为铜死亡正向评分和铜死亡负向评分，铜死亡活性评分被定义为两者之差。根据铜死亡活性评分，我们通过Spearman相关分析来确定铜死亡表型相关基因。只有相关系数的绝对值 > 0.3且p < 0.001的基因被纳入。随后，使用R软件包 "clusterProfiler "进行GO富集分析和KEGG通路分析。

甲基化分析

TCGA样本的DNA甲基化数据（Methylation450K）是从Xena获得的，只有映射到铜死亡调节子启动子区域的探针才被用于后续分析。对于含有多个探针的基因，使用所有探针的平均β值作为甲基化水平。在差异甲基化分析中只保留了至少有5对配对的肿瘤-正常组织的16种肿瘤，并使用与差异mRNA表达分析相同的方法计算倍数变化和p值。随后，在整合了甲基化和铜死亡调控子的基因表达数据后，使用Spearman相关性分析确定了相关系数和p值。

结合铜死亡调节子的甲基化数据和临床信息后，基于Cox回归分析计算调节子甲基化的危险比。危险比 > 1代表高甲基化与不良OS相关，表示高风险。根据每个调节子甲基化水平的中位数，将每种肿瘤类型分为两组，并进行log-rank检验计算p值。

miRNA, lncRNA以及TF分析

TCGA样本的标准化miRNA表达数据是从Xena下载，并对批量效应进行了校正。从数据库中收集了可能调控铜死亡调节子的miRNA数据，包括经过实验验证的（miRTarBase v9.0和TarBase v8.0）以及预测的（Targetscan v8.0）miRNA-mRNA对。随后，来自TCGA的miRNA和mRNA表达数据被整合，对于每个肿瘤类型，使用Spearman的相关性分析分别计算每个miRNA-mRNA对的相关性。只有相关系数 < -0.2和p < 0.05的miRNA-mRNA对被认为是潜在的调控对。miRNA调控网络是用Cytoscape_v3.8.2构建的。

LncRNA和TF的调控数据来自以前的一项泛癌症研究。利用这些数据，我们筛选了每个肿瘤中潜在的靶向铜死亡调节子的lncRNA-mRNA对和TF-mRNA对，并利用Spearman相关性分析计算每个肿瘤类型中每个lncRNA-mRNA和TF-mRNA对的表达相关性。只有相关系数绝对值 > 0.2且p < 0.05的lncRNA-mRNA对和相关系数绝对值 > 0.3且p < 0.05的TF-mRNA对被保留。LncRNA和TF调控网络是用Cytoscape_v3.8.2构建的。

生存分析

使用Sangerbox（http://vip.sangerbox.com/home.html）进行生存分析。患者的生存状态和临床信息可以在表S13中找到。在整合了铜死亡调节子表达数据、铜死亡评分和临床信息后，根据Cox回归分析计算每个变量相对于每个肿瘤类型的OS、DFI和PFI的危险比，以确定高风险或低风险。以每个变量的中位数为分界值，将每种肿瘤分为两组，并进行log-rank检验以确定p值。对于OS，使用最佳分界值将肿瘤分为两组，绘制Kaplan-Meier生存曲线并进行log-rank检验。此外，我们从GlioVis（http://gliovis.bioinfo.cnio.es/）的CGGA数据集中获得了一个LGG队列以验证铜死亡调节子和评分的预后价值。

通路活性分析

从MSigDB数据库（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/）下载癌症标志基因集并使用GVSA算法推断TCGA中所有肿瘤样本的标志通路得分。我们从Saul等人最近的一项研究中获得了最新的细胞衰老基因集。细胞周期基因集也是从MSigDB数据库中获得的。随后用Spearman相关性分析计算了每种肿瘤类型的铜死亡活性评分和每个通路/特征之间的相关性。此外，突变负担、HRD评分、 杂合度丢失 ( LOH )评分、大规模状态转换 (LST)评分和端粒等位基因失衡 (TAI)评分都是从以前的研究中收集的。HRD得分是LOH、LST和TAI得分之和。

免疫特征分析

使用ESTIMATE算法推断出每个肿瘤样本的ImmuneScore（代表免疫细胞浸润的总体水平）、StromalScore（代表基质浸润的总体水平）和ESTIMATEScore（与肿瘤纯度呈负相关）。并使用Spearman相关性分析计算每个肿瘤类型的铜死亡活性评分和这三者之间的相关性。基于CIBERSORT算法计算的22种免疫细胞的丰度是从以前的出版物中收集的。我们计算了每种肿瘤类型的免疫细胞丰度和铜死亡活性之间的相关性。此外，免疫激活相关基因、免疫检查点相关基因和TGF-β/EMT通路相关基因都是从Zeng等人以前的出版物中收集的。

对于免疫治疗数据集，IMvigor210队列的基因表达数据和临床信息来自IMvigor210 Core Biologies（http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies）。基因表达数据被转换为TPM值，并进行log2（x+1）转换。GSE78220队列的标准化基因表达数据和临床信息来自Gene Expression Omnibus数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。基因表达数据进行了log2(x+1)转换。

药物敏感性分析

从GDSC数据库中下载了809个肿瘤细胞系的标准化基因表达数据和每个细胞系对198个化合物的反应数据，并将药物反应数据转换为IC50。随后计算每种药物的铜死亡活性与IC50之间的Spearman相关性，只有相关系数绝对值 > 0.1且p < 0.05的药物才被认为与铜死亡相关。然后将药物靶点数据与筛选出的药物进行匹配。此外，我们根据oncoPredict算法，以这些细胞系的基因表达谱和药物反应数据为训练集，估计了每一种药物在单个ACC 患者中的IC50。

包含更多细节的方法可以在补充材料中找到。

代码和数据可用性：

本研究所生成的数据可在文章及补充材料中找到。本研究中所分析的数据来自Xena（https://xenabrowser.net/datapages/）、GlioVis（http://gliovis.bioinfo.cnio.es/）、IMvigor210（http://research-pub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies）和GSE78220队列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。本研究中所使用的代码可以在GitHub（https://github.com/Changwuuu/Cuproptosis-pancancer.git）中找到。

所有的补充材料（文本、图、表、中文翻译版本或视频）也可从线上获取

引文格式：

Changwu Wu, Jun Tan, Xiangyu Wang, Chaoying Qin, Wenyong Long, Yimin Pan, Yuzhe Li, Qing Liu. 2022. Pan‐cancer analyses reveal molecular and clinical characteristics of cuproptosis regulators. iMeta e68. https://doi.org/10.1002/imt2.68

作者简介

吴长武（第一作者）

●   中南大学湘雅医院医师，德国医学博士，获国家优秀自费留学生奖学金

●目前研究方向为肿瘤免疫、肿瘤代谢以及生物信息学。参与国家自然科学青年基金项目一项，参译《脊索瘤》专著一部。担任Front Public Health 及Front Pain Res 客座副编辑，担任Front Immunol, Cell Mol Biol Lett，Pharmgenomics Pers Med等多家SCI期刊审稿人。以第一/通讯作者发表SCI论文13篇，相关学术成果发表于iMeta，J Big Data，Cancers等期刊。

刘庆（通讯作者）

●  中南大学湘雅医院教授，博士生导师，留美博士后

●研究方向为颅底脑干肿瘤显微手术、神经肿瘤发病机制与靶向治疗、脑胶质瘤的分子免疫治疗。担任中南大学湘雅医院神经外科副主任兼颅底神经外科主任、湖南省颅底外科与神经肿瘤研究中心副主任及中南大学神经外科研究所副所长。主持国家自然科学基金、科技部十二五科技支撑项目、湖南省科技计划重点项目等10余项基金和人才项目。担任国家自然科学基金项目评审专家以及Theranostics等多家SCI期刊审稿人。以通讯作者或第一作者在Clin Transl Med、Neuro Oncol、Mol Ther、Oncogene等权威杂志发表文章40余篇

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“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 15)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！

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