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MBPD：践行一体化健康的多种病原细菌检测流程

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研究论文

● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.82

● 2023年1月31日，南京农业大学韦中团队在iMeta在线发表了题为“MBPD: A multiple bacterial pathogen detection pipeline for One Health practices”的文章。

● 本研究提出了一个多病原细菌检测系统(MBPD)，以识别动物、植物和人畜共患类病原菌。与其他方法(如16SPIP和MIP)相比，MBPD可检测到的病原菌范围更广，还能够从生物和环境样本中识别潜在的复合感染病菌。综上，该流程为一体化健康背景下的农业、畜牧业、医药和环境病原菌风险监测及预防等提供重要参考依据。

● 第一作者：杨欣润、江高飞

● 通讯作者：江高飞 ([e-mail])、韦中 ([e-mail])

● 合作作者：张耀中、汪宁祺、张煜玲、王孝芳、赵方杰、徐阳春、沈其荣

● 主要单位：南京农业大学资源与环境科学学院、生物互作与有害生物绿色防控重点实验室、土壤健康国际合作联合实验室、国家有机类肥料工程技术研究中心、江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室、江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心

亮   点

●  Multiple bacterial pathogen detection (MBPD)是基于一款基于16S rRNA基因测序检测动物、植物和人畜共患类病原细菌的流程

●  MBPD数据库涵盖了1986种已报道病原细菌的72,685条序列

●  MBPD通过虚拟试验，为16S 常见测序区域提供最佳注释阈值，提升了检测准确率

●  MBPD在检测致病菌和复合感染病菌方面具有较大优势

摘   要

病原细菌严重威胁生物和环境健康，前沿的检测技术是消减病原菌的重要先决条件。目前，16S 测序在病原细菌的广谱性检测中具有显著优势。然而，该方法的注释分辨率和适用性受到特异性病原体数据库、注释阈值和16S 可变区测序的影响。基于此，本文提出了一个多病原细菌检测系统(MBPD)，以识别动物、植物和人畜共患类病原菌。MBPD基于1986种已报道病原细菌构成的大型数据库，涵盖72,685条全长序列。通过虚拟试验，MBPD为全长和可变区测序平台提供了合适的注释阈值，其中V3-V4(平均精度88.37%)在病原鉴定方面优于其他可变区。对真实环境数据的基准测试表明，与其他方法(如16SPIP和MIP)相比，MBPD可检测到的病原菌范围更广。除可检测人类、动物和植物疾病的致病菌外，MBPD还能够从生物和环境样本中识别潜在的复合感染病菌。综上，该流程为一体化健康背景下的农业、畜牧业、医药和环境病原菌风险监测及预防等提供重要参考依据。

视频解读

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全文解读

引  言

致病菌感染是“一体化健康”所面临的重大挑战之一。过去20年里，全球每年约1500万人死于传染病，约30%的粮食产量损失于植物病害。此外，新冠疫情对全球公共安全及经济造成的损失，人畜共患宿主多样性的增加，以及植物致病菌的大流行，均表明全生境(人-动物-植物环境)病原菌检测对于病害管理和生态健康维护的重要性。此外，复合感染(Coinfection)在自然和农业环境中都很常见。当前的一大问题是，复合感染病原菌之间存在相互协同作用，一种病原菌的存在会增加另一种病原菌的丰度或毒性。然而，当前还没有有效检测复合感染的方法。许多国家/国际组织，如NCBI、世卫组织和国际植物病理学会植物致病菌分类委员会(ISPP-CTPPB)，一直在收集相关病原菌信息，但信息均较为零碎，无法满足生物和环境样本中病原体感染的全面检测以及“一体化健康”的要求。

病原菌检测主要分为依赖培养和不依赖培养两种方法。前者作为病原菌检测的经典试验，主要依靠培养和生化检测，可提供满足科赫氏法则的能力、药物敏感性和生化检测等关键信息，但耗时较长，且受病原菌可培养性的限制。不依赖培养的方法包括PCR和基于高通量测序的方法。PCR或探针减少了病原菌鉴定的时间，但过度依赖引物的特异性和数量，检测结果易出现假阳性。常见的基于高通量测序的方法包括16S/ITS/18S/rpoB/cpn60扩增子测序和宏基因组测序。基于病原菌序列，测序方法能够识别样本中几乎所有类型的病原菌。与培养依赖和PCR方法相比，测序方法的主要优点是高通量，但需匹配合适的分析流程以达到高灵敏度。

16S 测序广泛应用于动物、食物、水、土壤和植物样品中的病原细菌检测。然而，其检测范围和灵敏度高度依赖于测序方法、可变区测序、病原菌数据库和分析流程。短读长测序具有高通量和低成本的优势，但序列长度较短。长读长测序能够生成长序列以及高分辨率的分类学地位，但其测序错误率约为13%。另外，不同的生物信息学方法会影响病原菌的组成和丰度。例如，常用数据处理方法包括OTU聚类或ASV方法。相比OTU聚类，基于ASV的方法具有测序误差更小、分辨率更高等优点。此外，病原菌检测结果易受参考数据库、测序区域和注释阈值的影响而波动。当前基于16S 测序已经开发了几种病原体检测流程，如16SPIP， MIP和Krishna，但它们仅针对与人类感染或水质相关的病原菌。而病原菌在多个宿主和环境中的广泛分布和传播，亟需一种新流程以系统、快速地检测适合所有生境的病原菌，为人类、动物和植物中共存的多种病原菌的一体化健康诊断和治疗提供基础。

本研究开发了一种基于16S 测序的病原细菌检测流程——多病原细菌检测系统(MBPD)，以准确检测病原菌。为全面鉴定样本中的病原菌并满足不同可变区测序准确鉴定病原细菌的需求，构建了全长病原菌数据库及匹配ASV方法中的DADA2流程进行数据处理，并通过虚拟试验评估了各可变区的最佳注释阈值。MBPD能够广泛地检测动物、植物和人畜共患病原细菌，对于食品安全、流行病预防、疾病诊断和环境监测至关重要。MBPD可以在https://github.com/LorMeBioAI/MBPD上公开获得。

结  果

MBPD概述

本文开发了一款基于16S 测序较为全面检测病原细菌的方法MBPD。MBPD的输入为清洗后的16S扩增子数据，输出为带有病原菌分类的ASV表。本流程包括以下步骤：(1)将收集的病原细菌信息与Silva 16S数据库进行比对，建立MBPD数据库；(2)利用MBPD数据库进行虚拟试验，利用UCLUST算法对16S的不同可变区进行物种/菌株注释的最佳相似度和准确性研究；(3)使用DADA2工具将16S扩增子数据转换为ASV序列；(4)根据不同的测序区域，使用合适的注释阈值将ASV序列与MBPD数据库进行比对，其中V4和V1-V2区域推荐90%阈值，其他可变区域推荐80%(图1)。

图1. MBPD工作流程

MBPD首先从公开的文献、数据库和网络资源中收集和整理会引起动物、植物和人畜共患疾病的病原细菌，构建病原菌数据库，共有72,685条16S全长序列。然后，通过虚拟试验对16S各可变区的准确率和合适阈值进行评估。清洗后的生物/环境样品16S数据通过DADA2工具，获得ASV序列。最后，利用UCLUST算法及合适阈值与MBPD数据库比对，获得病原菌ASV表。

一个包含72,685条16S序列的大型病原菌数据库

为构建引起动物、植物和人畜共患疾病的病原菌数据库，本研究从公共机构、数据库和论文中收集了1986种病原细菌(表S1和S2)。总的来说，它们主要属于四个门，分别是Proteobacteria(758)、Firmicutes(558)、Actinobacteria(388)和Bacteroidetes(123) (图2A)。然后，从Silva数据库中提取了这些病原菌在物种或菌株水平上的序列，称为MBPD数据库，以提高数据的兼容性和更好地识别病原菌多样性。概括来说，MBPD数据库主要由门水平上的变形菌门(39,582)、厚壁菌门(24,284)、放线菌门(4660)和拟杆菌门(1449) (图2B)和属水平上的芽孢杆菌(6945)、志贺杆菌(6187)、沙门氏菌(5251)和假单胞菌(4360)组成(图2C)。此外，相比植物类病原菌(3360/72,685，4.6%)，大量病原菌来自于人畜共患类 (35493/72,685，48.9%)和动物类(33832/72,685，46.5%)(图2B和图S4)。每个物种的序列号信息详见表S5。

图2. MBPD数据库

（A）基于MBPD数据库中1986种病原细菌16S序列的系统发育树。分支的颜色代表相应的门，外圈表示病原菌的引发动物、植物和人畜共患疾病的类型；（B）门水平上MBPD数据库的基本分类组成。图中只显示了相对丰度前10个门，其余门合并为Others；（C）属水平上MBPD数据库的分类组成，图中仅展示相对丰度前10个属。

不同注释阈值下各测序平台及可变区的虚拟试验

16S 基因由9个可变区组成，分布在高度保守的序列中(图3A)。为了对不同测序平台和扩增子可变区提供更好的检测效率，本研究进行了虚拟试验，比较了各可变区下的物种缺失率以及不同注释阈值下的注释准确率和运行时间(图3，图S1和图S2)。首先，各可变区与PCR引物的匹配程度存在较大差异。V1-V2、V1-V3和V6-V9区的丢失率最高，不匹配率为29.3%-33.22% (图S2A)，主要属于三个门(变形菌门、厚壁菌门和放线菌门)(图3B和图S1)。同时，某些病原菌属的检测在缺失率较高的可变区测序时可能不稳定(图3B)。例如，植物致病性Candidatus Phytoplasma spp. 在V1-V2、V1-V3和V6-V9区的丢失率较高，而人类致病性Mycoplasma spp.在V3-V5、V4-V5和V5-V7区域的丢失率较高(图3B)。其次，各个可变区在病原菌注释的准确性上存在明显差异(图S2B)。V1-V9区(全长)效果最好(ANOVA: F8,1341 = 183.9, p < 0.001，图S2B)。消除注释阈值带来的差异后，V1-V3和V3-V4可变区的准确率仅次于V1-V9 (ANOVA: F7,1192 = 174.7, p < 0.001，图3E)。综上所述，注释阈值会显著影响病原菌检测的准确性和运行时间。在准确性方面，大多数可变区在80%阈值时表现最好，但V4和V1-V2区域在90%阈值时表现最好(图3C)。从获得最佳检测精度的角度出发，全长测序和V3-V4测序的注释阈值都建议为80%，但80%阈值的运行时间比在其他阈值时更长(图3D)。

图3. 16S可变区的虚拟试验

（A）Illumina和全长测序的16S可变区靶点。根据微生物组研究中常用的PCR引物，对MBPD的16S全长数据库进行裁剪并生成各可变区序列的虚拟试验。随后从中提取10,000条序列，重复30次进行病原体比对；（B）虚拟试验下病原细菌属水平上的丢失率。各分面表示16S可变区测序目标(V)。柱状图颜色表示丢失病原菌的门水平。C‐Phytoplasma和BCP分别代表Candidatus Phytoplasma和Burkholderia‐Caballeronia‐Paraburkholderia；（C）不同注释阈值(80%、90%、95%、97%、99%)下，16S各可变区的物种注释准确率；(D) 不同注释阈值下各可变区的运行时间；(E)与V1−V9相比，子区域在病原菌检测中的准确率。不同小写字母表示不同可变区间准确率的差异显著(HSD检验：p < 0.05)。

MBPD在病原菌检测方面优于其他方法

本文选择了50例患者皮肤样本的16S数据，将MBPD与其他两个已发表的类似流程(16SPIP和MIP)进行比较。由于样本为V4数据，因此MBPD基于虚拟试验结果，采用了90%的注释阈值(图3C)。结果发现，MBPD在所有流程中检测到的病原菌数量最多，高达310个，并包含了大多其他两种流程检测到的病原菌，尤其是MIP(图4A)。从运行时间上看，MBPD与MIP在检测相同样本量的运行时间较为接近(图4B)。最后，由于16SPIP仅用于病原鉴定，而无法计算丰度，本文将优势属(丰度最高的6个属)的相对丰度与MIP进行了比较。MBPD能检测到MIP中的优势属Staphylococcus，以及MIP中未检测到的属，如Corynebacterium和Finegoldia(图S5A)。

图4. MBPD、16SPIP和MIP在病原细菌检测中的性能比较

（A）MBPD、16SPIP和MIP检测到的共有和特定病原菌种类的维恩图；(B) MBPD、MIP和16SPIP运行时长的比较。运行时间以分钟为单位。绿色、红色、棕色分别表示MIP、MBPD、16SPIP。

MBPD可准确识别真实样品中的致病菌及复合感染病原菌

最后，本研究在人类牙周炎、白虾病和植物青枯病的健康—患病的配对样本上测试了MBPD，以进一步评估MBPD在真实环境样本中的表现。所选取的三类样本是One Health(人类、动物和环境)的重要组成。由于均为V4数据，MBPD采用90%阈值对所有样本进行病原体比对。患病样本中病原菌群落和致病菌的丰度均显著高于健康样本(t检验，p < 0.001，图5A和图S3A−C)，但健康样本中病原菌群落的均匀性显著高于患病样本(图S3D−F)。此外，MBPD能够检测到其他潜在的复合感染病原菌(图5B−D)。例如，人类和动物患病样本中高度富集的属(Treponema和Photobacterium；p < 0.001)可以从与致病菌相同的环境中分离出来，并严重威胁宿主。

图5. 健康和患病样品中病原菌的检测

人类、动物和植物根际样品中致病菌相对丰度的差异(A)；人类(B)、动物(C)和植物根际(D)样品中其他潜在病原菌属的相对丰度差异。采用配对t检验进行统计学分析(*p < 0.05；** p <0.01；*** p < 0.001；**** p < 0.0001)

讨  论

本研究推出了MBPD，一种利用16S 测序从生物/环境样本中全面识别病原细菌的方法，可有效评估环境和生物样本中的致病细菌风险程度。此外，MBPD是一种以一体化健康为导向的病原菌检测方法，由一个大型、通用的参考病原菌数据库推动。其主要创新点包括(i)一个相对完整的数据库，便于检测感染动植物及人畜共患类病原菌；(ii)为当前常见的16S可变区测序提供合适的阈值，用于序列比对；(iii)病原菌检测和定量的高性能；(iv)从生物和环境样本中准确鉴定致病菌及其复合感染病菌；以及(v)不断更新病原菌数据库和流程的开源工具。

病原菌检测的性能受到参考数据库、测序区域和相似阈值的影响。较小的数据库限制了检测到的病原体丰富度，不同的测序区域会导致检测到的病原菌存在差异。基于此，MBPD基于Silva数据库构建了大型病原菌参考数据库，因为Silva数据库较为全面且更新及时。然而，不同测序区域下的最佳相似阈值仍然未知。本文通过虚拟试验评估了不同阈值下各可变区的检测效率及精度，并选择UCLUST作为序列比对工具，因为UCLUST在物种水平上对16S序列的比对性能显著优于其他所有方法。虚拟试验结果表明，在80%阈值下使用MBPD进行16S全长测序表现最好，但子区域可能会降低微生物组样本中的病原菌丰富度。此外，考虑到Illumina测序平台的广泛使用(短读长，低成本)，本文还提供了各种常见测序区域(V1-V2, V1-V3, V3-V4, V3-V5, V4, V4-V5, V5-V7, V6-V9)下的最佳阈值，以获得最佳检测结果。最后，MBPD能够从样本中检测出复合污染病原菌。例如，恶劣的环境中易发生大量交叉感染，但具体的病原菌并不清楚，或是对当前主要病原菌进行相关处理后，却增加了其他病原菌的密度。MBPD还可以用于更深入地了解病原菌，例如阐明样本中的病原菌多样性及其对环境变化的响应。

虽然有一些工具可以使用16S序列来识别病原菌，但仍需要一项基准研究来评估MBPD与这些流程的性能比较。本文下载了50例患者皮肤样本的16S测序数据，并使用这些工具进行了测试。本研究表明，在处理相同数据时，MBPD优于其他现有工具：MBPD具有最高的病原菌丰富度，优势病原体与其他工具一致，这可能是由于较全面的数据库提供了更广泛的病原体检测。此外，本文使用人类、动物和植物的患病-健康样本的16S数据以探究MBPD的准确性。结果发现，三种类型的样品都能准确检测到致病菌和潜在的复合污染病原菌。

虽然MBPD在病原菌检测方面具有较好的表现，但仍存在一些局限性和挑战。首先，短读长导致病原菌的分类分辨率受到限制。与全长测序相比，16S子区域的性能在种/菌株水平上最多达到90%的相对精度(图3D)。短读长测序在检测种水平上的不同菌株或近缘种时存在不稳定的现象。例如，葡萄球菌被MIP鉴定为无害的表皮葡萄球菌，但被MBPD识别为致病的金黄色葡萄球菌(S5B,C)。当前，通过长读长 (PacBio和MinION)和蛋白质编码分类标记(rpoB和cpn60) 测序在亚属水平上鉴定菌株可获得较好的分类分辨率，但在属水平以下鉴定表现不理想。其次，病原菌检测具有引物偏好性。研究表明，V4在利用OTU聚类识别肠道病原体或Greengenes数据库识别植物病原菌时不稳定。但通过自建病原菌数据库结合ASV的方法可准确检测这两种病原菌(图4A和图S1)，表明分析方法和数据库对于物种分类学地位至关重要。然而，由于16S的菌株分辨率有限，MBPD难以检测到植物病原体Candidatus Phytoplasma spp. (漏检率 >75%，图S1)。因此，植物病原体的鉴定可以依赖于一些蛋白质编码分类标记(rpoB和cpn60)或应用于16S以外的多个基因的PCR测序方法。最后，测序方法缺乏病变的直接证据。虽然病原菌污染的组成和风险可通过扩增子和宏基因组测序方法进行评估，但有关致病菌、病变和疾病类型的真实情况仍需进一步的试验验证和分析方法的进步。例如MIP便有助于了解病原菌、疾病类型和人体病变之间的关系。

方  法

MBPD数据库构建

本文首先从各种研究和数据库中收集了动物、植物和人畜共患病原菌的信息，如16SPIP、FAPROTAX和Bull等 (详见表S1)。基于物种水平，与Silva 138.1 SSU Ref NR 99细菌数据库（以99%的同源性剔除冗余序列）进行比对，获得包含72,685条序列的病原菌参考数据库，并在Silva数据库基础分类中添加病害类型的标签(表S4，type)。对于未分类的病原体，我们进一步在NCBI分类数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy)中搜索相对准确的分类信息。然而，考虑到Silva数据库中的物种和菌株级别不能很好地区分，添加了一个物种级别的标签(表S4, species_manual)。为了构建和探索病原菌的系统发育关系，基于最大似然方法，使用MAFFT对所有物种(1986)的序列进行比对。使用FastTree2构建系统发育树，并利用iTOL网络工具(https://itol.embl.de)进一步可视化。

不同阈值下16S 的虚拟试验

对16S全长序列的MBPD数据库进行虚拟试验。使用USEARCH search_pcr2命令对引物序列(支持信息:表S2)定义的区域进行修剪，从而生成了划分16S基因不同子区域的病原菌序列。如果一个或多个可变区域无法匹配引物，序列将被丢弃。为了确定不同可变区和阈值所提供的分类分辨率，在硅扩增子中使用SeqKit从每个序列中随机选择10,000个序列，并使用UCLUST算法在MBPD数据库中重复分类30次，并设置不同的相似阈值(80%、90%、95%、97%和99%)。准确率计算方法为：准确率= 100*(准确率_全长/准确率_子区域，探讨各可变区在病原鉴定中的最佳表现。用缺失率= 100*(总数_病原菌门-丢失数量_病原菌门)/ 总数_病原菌门来表示在虚拟试验中各可变区序列无法匹配的比例。

数据处理

修剪过后的序列使用DADA2工具进行处理，该流程可获得具有单核苷酸差异的序列，即ASV。采用严格的标准对reads进行修剪和过滤，每个reads最大期望误差为1 (maxEE = 1)。合并双端reads和去除嵌合体后，根据虚拟试验结果，选择合适的阈值，利用UCLUST算法与MBPD数据库比对，分析每个病原菌序列的系统进化相关性。

用于测试MBPD性能的扩增子测序数据

为了比较MBPD与16SPIP、 MIP的性能差异，本文随机挑选了50例患者皮肤样本（16S V4扩增子数据）进行分析，这些样本之前已在MIP流程上进行了测试。此外，根据登录号，从NCBI下载了来自人类、动物和植物样本的三个已发表的16S V4区域数据，包括成对的健康和患病样本:牙周炎(致病菌：Porphyromonas gingivalis、白虾病(Vibrio parahaemolyticus)和植物青枯病(Ralstonia solanacearum)。原始序列首先使用fastp进行处理，以去除低质量的reads、潜在的引物和条形码。然后，使用QIIME join_paired_ends.py命令合并双端reads。最后，使用MBPD管道处理修剪后的fastq文件。

统计分析

t检验(双侧)用于检验样本对之间的统计学显著性，其中p值低于0.05被认为具有统计学显著性。采用方差分析和Tukey检验来确定多重比较的统计学意义。所有统计分析均使用R 4.1.2软件(www.r-project.org)进行。

代码和数据可用性：

MBPD可以在GitHub (https://github.com/LorMeBioAI/MBPD)上公开使用。补充资料(图表、表格、脚本、图形摘要、幻灯片、视频、中文翻译版本和更新的材料)可在在线DOI或iMeta Science http://www.imeta.science/中找到。

引文格式：

Xinrun Yang, Gaofei Jiang, Yaozhong Zhang, Ningqi Wang, Yuling Zhang, Xiaofang Wang, Fang‐Jie Zhao, Yangchun Xu, Qirong Shen, and Zhong Wei. 2023. “MBPD: A Multiple Bacterial Pathogen Detection Pipeline for One Health practices.” iMeta e82. https://doi.org/10.1002/imt2.82

作者简介

杨欣润（第一作者）

●  南京农业大学2021级博士生

●  研究方向为土壤生物复合污染过程与调控

江高飞（一作兼通讯作者）

●  南京农业大学副研究员

●  主要从事土壤生物健康研究。发表论文 33 篇(其中 SCI 收录论文 23 篇)，其中第一和通讯作者论文 13 篇。近 3 年，相关研究成果分别在iMeta、ISME J、ISME Commun、Microbiol Spectr (2022)、Bioresour Technol、Soil Ecol Lett等国际权威杂志发表。获授权/受理中国发明专利 10 件。获得 ISME 青年科学家等 2 项国际奖励

韦中（通讯作者）

●  南京农业大学教授，博士生导师

●  从事根际微生态与土壤生物障碍研究。主持了国家自然科学优秀青年基金、国家重点研发青年科学家和英国皇家科学院等项目。研究成果以第一或通讯作者发表在iMeta、Nature Biotechnology、Nature Microbiology、Nature Communications、Science Advances、ISME J、Ecology Letters、Microbiome等国际著名期刊。以第三完成人获得2018-2019年度神农中华农业科技一等奖。2020年获得中国农学会青年科技奖。担任iMeta、Soil Ecol Lett副主编以及Microbiome、土壤学报和农业环境科学学报等期刊编委，受聘中国土壤学会土壤生物与生化专业委员会委员、中国生态学会微生物生态学专业委员会委员、江苏省土壤学会理事兼青年工作委员会主任委员

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