iMeta | 农科院资划所曹卫东组揭示种植利用豆科绿肥内源驱动土壤自生固氮的作用
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长期施肥制度下固氮菌和丛枝菌根真菌协同作用对土壤自生固氮的影响
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综 述
● 原文链接DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.81
● 2023年1月27日，中国农业科学院资划所曹卫东团队在 iMeta 在线发表了题为“Synergistic effects of diazotrophs and arbuscular mycorrhizal fungi on soil biological nitrogen fixation after three decades of fertilization ”的文章。
● 本研究首次发现了种植利用绿肥内源驱动土壤自生固氮的证据，同时为研究土壤自生固氮与菌根真菌的关系奠定基础。
● 第一作者：周国朋
● 通讯作者：曹卫东 (caoweidong@caas.cn)
● 合作作者：范坤坤、李桂龙、高嵩涓、常单娜、梁婷、李顺、梁海、张久东、车宗贤
● 主要单位：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、中国科学院南京土壤研究所、江西省农业科学院土壤肥料与资源环境研究所、南京农业大学、甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所
亮 点
● 长期施肥（尤其有机施肥）提高土壤自生固氮活性
● 土壤固氮菌及丛枝菌根真菌群落丰度与土壤自生固氮活性呈显著线性正相关
● 由固氮菌和丛枝菌根真菌组成的关键生态集群在土壤自生固氮中起重要作用
● 长期施肥降低固氮菌及丛植菌根真菌之间的协同关系
● 种植利用绿肥能够强化关键生态集群中固氮菌与丛植菌根真菌的协同关系
摘 要
生物固氮是将大气氮转化为生物可利用氮的重要生态过程。虽然固氮菌在土壤生物固氮中起主导作用、丛枝菌根真菌（AMF）可促进固氮菌生物固氮，但土壤自生固氮活性和固氮菌群落对长期施肥的响应以及AMF在固氮菌驱动土壤自生固氮中的作用尚不清楚。本文基于一个小麦-玉米间作系统中长达33年的长期施肥试验，研究了长期施肥（包括施用化肥、牛粪、秸秆还田、种植利用绿肥）对土壤自生固氮活性、固氮菌与AMF群落及三者间关系的影响。研究发现，与不施肥对照相比，长期施肥显著提高土壤自生固氮活性，且以种植利用绿肥处理增幅最大。这主要与长期施肥处理下土壤固氮菌、AMF的绝对丰度及二者共现网络中关键生态集群Module #0（固氮菌以 Skermanella 和 Azospirillum 为主）相对丰度增加有关。长期施肥（尤其有机施肥）削弱了固氮菌与AMF之间的协同关系，但种植利用绿肥加强了关键生态集群Module #0中固氮菌与AMF之间的协同作用，该协同关系与土壤自生固氮潜力呈显著正相关。本文首次发现了种植利用绿肥内源驱动土壤自生固氮的证据，同时为研究土壤自生固氮与菌根真菌的关系奠定基础。
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全文解读
引 言
生物固氮（BNF）是将大气氮转化为生物可利用氮的重要一环，陆地生态系统每年通过共生和非共生（自生）固氮过程固定的氮可达40~100 Tg。虽然共生固氮过程对全球生物固氮总量的贡献较大，但自生固氮过程几乎无处不在，存在于土壤、枯枝落叶层，乃至植物的茎、叶之中，对全球陆地系统氮收支同样至关重要。如有研究报道，农田土壤自生固氮量每年可达22-53 kg N ha-1。然而，固氮微生物的固氮功能以及给农业生产带来的效应很大程度上受到了大量无机或有机氮输入的挑战。这是因为固氮菌直接从土壤吸收氮所需的能量成本远远低于生物固氮过程，富氮环境下固氮菌将降低生物固氮活性或被非固氮菌抢夺生存空间。但现有证据表明，大量氮肥投入对农田土壤自生固氮活性的影响存在不确定性。一项基于森林生态系统的研究也认为，土壤养分有效性，包括氮或磷，并不是预测土壤自生固氮活性的良好指标。截止当前，有关环境因素对土壤固氮菌群落的影响已有大量报道，但我们对调控土壤固氮菌自生固氮活性的因子依然不明，特别是在受到人类剧烈干扰的农业系统中。
虽然理论上固氮菌在营养贫乏的环境中具有更强的自生固氮优势，但施肥对固氮菌群落的影响仍不确定，即在以往的施肥试验中，有机或无机施肥后固氮菌的丰富度和多样性变化不一。土壤固氮菌也因栖息环境的变化存在不同的固氮菌类群。例如，短期施用氮肥能够增加快速增长型（富营养型）固氮菌丰度，如 Sphingomonas 和 Burkholderia ，二者分别隶属为α-变形菌纲和β-变形菌纲；而长期施肥，包括长期施用氮肥，增加隶属于δ-变形菌纲的 Geobacter 的相对丰度，此类细菌通常被归类为寡营养型细菌。基于上述研究结果发现，通过参照固氮菌的营养特性或生活习性来预测其对施肥的响应存在一定的偏差。因此，进一步厘清施肥对固氮菌群落的影响，对于制定合理的施肥制度以维持较高的土壤自生固氮活性具有重要意义。
丛枝菌根真菌（AMF，隶属球囊菌门）能够较好的促进宿主植物生长，如改善宿主植物养分吸收、提高植物抗性、驱动土壤碳氮循环等。AMF还可以通过影响植物根际与菌丝际的固氮菌来控制土壤自生固氮。如，AMF可通过菌丝来高效传输养分，促进固氮菌之间的养分交流或异养非固氮菌的生长，进而调节固氮菌群落。有证据表明，AMF能够促进 Azospirillum 和Frankia 生物固氮。近期也有研究表明，AMF与固氮菌之间普遍存在着协同而非拮抗关系，但是与低氮处理土壤相比，高氮处理将会削弱AMF与固氮菌之间的种间关系。高氮环境抑制土壤固氮菌和AMF生长，可能是两者种间关系减弱的重要原因之一。然而，尽管已有研究证实，施肥可以调控固氮菌及AMF之间种间关系，但种间关系如何影响土壤自生固氮活性，尚不清楚。
近年来，利用微生物共现网络研究微生物之间的互作关系已成为常用的方法之一。研究表明，在土壤生态系统中，复杂的微生物共现网络可以被划分为若干重要的生态集群（也称模块），以维持微生物群落组成和行使某一功能。如有研究认为，土壤多功能性是由某个生态集群中微生物的多样性和群落驱动的，而非土壤全部的微生物群落；也有研究证明，土壤自生固氮能力与关键生态集群中固氮微生物的相对丰度有关。可见，利用基于微生物共现网络划分的微生物生态集群，将是推断土壤微生物组与土壤功能之间潜在关系的重要工具。然而，迄今为止，尚没有研究利用该方法分析土壤固氮菌与AMF之间的种间关系以及二者在调控土壤自生固氮中的作用。
基于上述研究背景，本文利用位于甘肃武威的长期施肥试验（始于1988年），选用不施肥对照（CK）、施用氮肥（CF）、施用牛粪（CM）、小麦秸秆还田（WS）、种植利用绿肥（GM）5种典型施肥处理，结合土壤自生固氮活性量化、nifH 和18S rRNA 基因荧光定量与高通量测序分析，研究不同施肥制度下的土壤自生固氮活性及潜在微生物机制。我们提出的科学猜想为：1）长期施肥将抑制土壤自生固氮能力，并极大改变土壤固氮菌群落组成，使土壤中氮素来源不再依赖于固氮菌的固氮作用；2）与整个微生物群落相比，固氮菌和菌根真菌所形成的特有共现网络生态集群能够更好地表征土壤自生固氮活性；3）长期施肥形成的富养环境将削弱固氮菌与菌根真菌的协同关系。
结 果
长期施肥管理下土壤自生固氮活性、固氮菌及AMF群落特征
经30年施肥处理后，土壤自生固氮活性（BNF）较不施肥处理（CK）显著提高（P < 0.05），各处理BNF大小顺序依次为GM > WS > CM≈CF > CK（图1A）。除WS处理对AMF的影响外，长期有机施肥处理（包括CM、WS和GM）显著（P < 0.05）增加了土壤中固氮菌和AMF的绝对丰度（图1B、1C）。回归分析显示，土壤BNF与固氮菌、AMF绝对丰度呈显著线性正相关（r2 = 0.71, P < 0.001；r2 = 0.48, P = 0.004, 图1D）。
置换多元方差分析（PERMANOVA）表明，长期不同施肥制度显著改变了固氮菌和AMF群落结构（R = 0.52, P = 0.001；R = 0.32, P = 0.001，表S3）。对于固氮菌，GM处理显著（P < 0.05）增加 Skermanella 和 Azospirillum 的相对丰度，有机施肥处理（包括CM、WS和GM）显著（P < 0.05）降低了Pseudacidovorax（WS处理除外）、Azohydromonas 和 Desulfobulbus 的相对丰度（图1E，图S4）。对于AMF群落，各施肥处理均显著（P < 0.05）降低了 Kamienskia 的相对丰度，CF处理显著（P < 0.05）增加 Septoglomus 的相对丰度（图1F，图S4）。有机施肥处理显著（P < 0.05）提高了固氮菌的物种多样性指数；除GM处理外，施肥均有效降低了AMF物种多样性（表S4）。Mantel检验结果表明，土壤pH、全量养分含量（包括有机碳、全氮和全磷）、速效养分（包括矿质氮、有效磷）显著（P < 0.05）影响固氮菌群落结构，而AMF群落结构主要受土壤全磷及有效氮磷比（即，矿质氮与有效磷的比值）调控（图S5A）。
图1. 长期不同施肥制度下土壤自生固氮活性及相关微生物群落特征
（A）土壤自生固氮活性；（B）nifH基因丰度；（C）18S rRNA基因丰度；（D）土壤自生固氮活性与固氮菌及丛枝菌根真菌基因丰度的线性回归分析；（E）不同施肥制度下优势固氮菌和丛枝菌根真菌在属水平下优势菌群的相对丰度。柱形图中不同小写字母表示处理间差异显著（P < 0.05，LSD检验）。
长期施肥管理下土壤固氮菌与AMF共现模式及系统发育特性
基于Spearman相关性矩阵，以土壤固氮菌和AMF的ASVs为节点，构建了固氮菌与AMF的共现网络（图S6A）。网络拓扑参数显示，CF处理的节点数和边数均低于其他处理，表明长期施用化肥降低了土壤固氮菌与AMF共现网络的复杂性（图S6B）。固氮菌与AMF总体共现网络可被分为4个主要生态集群，将其分别命名为Modules #0、#1、#2、和#3（图2A, 表S5），且每个模块均由不同属水平的固氮菌与AMF组成（图2B）。总体来看，Modules #0和#1以固氮菌为主，Modules #2和#3以AMF为主，且Modules #0和#3的微生物多样性要低于Modules #1和#2（图2B）。在Modules #0中，固氮菌 Skermanella 和 Azospirillum 为优势菌群；Pseudacidovorax、Methylocaldum、Variovorax和 Methyloversatilis 在Modules #1中占主导地位；均Modules #2和#3均以AMF中的 Glomus 和 Septoglomus 为主，且4个生态集群中的AMF均以 Glomus 相对丰度最高（图2B）。长期施肥显著（P < 0.05）增加生态集群Modules #0和#3、降低Module #2的相对丰度，其中以GM处理对Modules #0的增幅最大（图2C）。
图2. 基于固氮菌与丛枝菌根真菌的共现网络特征
（A）由四个主要生态聚群构成的优势固氮菌与丛枝菌根真菌的生态网络；（B）四个主要生态集群中不同固氮菌和丛枝菌根真菌属中ASVs个数的比例；（C）各施肥制度下主要生态集群的相对丰度；（D）共现网络中固氮菌与丛枝菌根真菌存在正相关ASVs的相对丰度。箱线图中不同小写字母表示处理间差异显著（P < 0.05，LSD检验）。
对各个生态集群中的固氮菌和AMF的系统发育多样性（观测值）进行计算，同时利用系统发育随机性抽样理论随机地从各自系统发育树上进行采样，得到系统发育多样性的预测值，通过比较观测值与预测值之间的差异性，发现长期不同施肥处理中Module #0、#2和#3中的固氮菌以及Module #0、#1和#3中的AMF的系统发育多样性的观测值与预测值差异不显著（95%置信区间）（图3）。然而，长期CM和WS处理下Module #1中固氮菌、长期CK处理下Module #2中AMF的系统发育多样性的观测值显著高于预测值，表明以上处理下Module #1和#2中的固氮菌和AMF群落均呈现系统发育的扩散性。结果表明，长期CM和WS处理可能定向选择Module #1中的固氮菌群，而长期施肥对Module #2中的AMF菌群具有定向选择作用。
图3. 长期施肥管理下不同生态集群中固氮菌（A）和丛枝菌根真菌（B）系统发育多样性的观测值与随机取样后计算获得的预测值之间标准化差异
黑色虚线表示随机取样后计算获得的预测值，灰色虚线表示95%置信区间。
对各个生态集群内部及生态集群之间物种的关联性进行统计分析，发现Module #0和Module #1之间存在强协同（正关联）关系，而Module #2与其余三个Module之间呈现拮抗（负关联）关系（表S5）。为进一步评价AMF对土壤自生固氮的作用，我们重点关注了与固氮菌存在正相关关系的AMF菌群，发现共现网络中有137个AMF节点（以Glomus sp.为主）和152个固氮菌节点（以Pseudacidovorax sp.和Skermanella sp.为主）存在协同（正关联）关系（表S6和S7），且大部分存在于Module #1和#2中。长期有机施肥降低了与AMF存在正相关的固氮菌的相对丰度，特别是在CM和GM处理下更为明显（图2D和表S8）。而这些固氮菌（与AMF正关联）受到土壤养分的调控，其相对丰度与土壤SOC、TN、TP、AP等呈现显著负相关（图S8A和S9）。这些结果表明，较高的土壤肥力会降低与AMF呈正关联的固氮菌的相对丰度，尤其在Module #2中（图2D）。值得注意的是，长期GM处理显著（P < 0.05）增加了Module #0中与AMF呈正关联的固氮菌的相对丰度，这与该处理降低了土壤矿质氮与有效磷的比值有关（图2D、图S8B和S9）。
长期施肥管理下固氮菌和AMF生态集群与土壤自生固氮的关系
固氮菌与AMF组成的生态集群Module #0和Module #2的相对丰度分别与土壤自生固氮活性之间存在显著线性正相关（r2 = 0.44, P = 0.007）和负相关（r2 = 0.45, P = 0.006）（图4A）。考虑到Module #0和Module #2与土壤自生固氮活性的关系，下文我们将其作为关键生态集群进一步关注。通过随机森林回归对两个关键生态集群中与土壤自生固氮活性高度正相关的固氮菌进行评估，结果显示Module #0和#2中分别有20个和8个与固氮活性密切相关的关键ASVs，而且它们分别在有机施肥（尤其GM）和不施肥（CK）处理中聚集（图4B和表S9）。在Module #0和#2中，分别有15%（3/20）和75%（6/8）的关键固氮菌与AMF存在正相关关系（表S9），可见在低肥力（如CK）土壤中固氮菌的自生固氮作用更需要AMF的协助。
图4. 土壤自生固氮活性与生态集群之间的关系
（A）土壤自生固氮活性与生态集群相对丰度之间的线性回归分析；（B）基于随机森林模型分析识别的关键生态集群（Module #0和#2）中与固氮活性密切相关的固氮菌ASVs丰度特征。
在考虑多个环境因素的影响后，利用偏最小二乘路径分析（PLS-PM）来评估固氮菌与AMF群落、协同关系及二者构成的关键生态菌群对土壤固氮活性的直接与间接效应。结果表明，固氮菌群落（包括固氮菌绝对丰度和α多样性）与自生固氮活性有直接显著（P < 0.05）的正影响，而AMF菌群的α多样性与自生固氮活性显著（P < 0.05）负相关（图5A和5B）。值得注意的是，由关键生态集群组成的潜在变量与固氮活性间没有显著的相关性，这与组成潜在变量的两个关键生态集群（Module #0和#2）对固氮活性的作用不一致有关。交叉载荷效应分析表明，关键生态集群Module #0中的固氮菌以及与AMF正关联的固氮菌相对丰度对自生固氮活性具有较大贡献（图5C），Spearman相关分析也证实了这一点（图S9）。从施肥制度来看，长期GM处理强化了Module #0对土壤自生固氮活性的积极作用。
图5. 偏最小二乘路径分析（PLS-PM）揭示了土壤生物与非生物因素对土壤自生固氮活性的影响
（A）PLS-PM模型描述了土壤理化性状、固氮菌和丛枝菌根真菌对土壤自生固氮活性的影响。潜在变量土壤理化性状由SOC、TN、TP、AP含量以及矿质氮与有效磷含量比值组成；潜在变量固氮菌群落和丛枝菌根真菌群落分别由各自的微生物功能基因丰度和α多样性指数组成；协同效应潜在变量由关键生态集群（Module #0和#2）中与丛枝菌根真菌正关联的固氮菌相对丰度组成。（B）土壤理化性质、固氮菌和丛枝菌根真菌对土壤自生固氮活性直接和间接影响的标准化路径系数。（C）PLS-PM中土壤生物与非生物因素对土壤自生固氮活性的交叉载荷系数。
讨 论
与长期施肥抑制土壤自生固氮、降低自生固氮活性的科学猜想H1相反，本研究涉及的施肥措施均提高了土壤自生固氮活性，而这些施肥制度无一例外地具有较高的全氮和矿质氮含量。近期一些在特定区域的研究也报道了类似的结果，几乎没有确切的证据表明土壤氮的有效性是调控土壤自生固氮活性的因素。本文的研究结果是对先前一些发现的拓展，即有机施肥和施用磷肥提高了土壤自生固氮活性；但也与前人许多发现形成鲜明对比，即土壤自生固氮活性随着施用氮肥、氮沉降等因素引起土壤全氮或矿质氮含量增加而受到抑制。本研究中，无机和有机施肥方式增加了土壤全氮和矿质氮含量，土壤自生固氮活性在各施肥处理下被显著提升，这可能与本研究土壤背景有机碳含量较低和磷限制有关。我们发现，本研究区域内的固氮菌类型是以依赖土壤碳提供能源的异养微生物为主，致使土壤有机碳含量增加对固氮菌活性的影响大于土壤氮富集的作用；施肥处理增加了土壤有效磷含量，这既能提高固氮菌自生固氮作用对ATP的需求，又能降低固氮酶周围环境的O2含量，促进固氮菌自生固氮作用。基于上述分析，我们认为有机碳和磷限制可能是导致本研究各施肥处理土壤自生固氮活性增加的关键因素。此外，区域尺度的研究通常认为，土壤自生固氮活性往往随着土壤N:P或C:(N:P)比值的增加或减少而降低或提升。我们的研究结果与前人的理论或者研究并非完全一致。例如，CM处理下土壤具有最低的N:P和最高的C:(N:P)，然而该处理下的土壤自生固氮活性显著低于长期WS和GM处理。综上所述，我们认为调控土壤自生固氮活性的环境因子因地而异。
土壤固氮菌往往是异养或兼性异养菌，添加外源有机物质会为其提供能量和营养，促进生长。本研究也表明，连续33年有机施肥后，土壤固氮菌绝对丰度增加了25%~156%，并且与土壤自生固氮活性呈显著线性相关。PLS-PM分析也进一步证实，固氮菌的绝对丰度是影响土壤自生固氮活性的第一要素。值得关注的是，长期施肥，特别是CM和GM处理，并没有因土壤有效磷的提升而降低AMF的绝对丰度，反而大幅增加，这与AMF为异养型真菌能在营养丰富的环境中大量增殖的习性有关。长期GM处理下AMF的绝对丰度最高，AMF可以形成大量菌丝为固氮菌自生固氮提供高效的养分（尤其P养分）运输通道，促使GM处理保持较高的自生固氮活性。以上研究也支撑了前人的研究结果，即农业系统中绿肥或豆科植物具有招募固氮菌和AMF的优势，表明生物因素（如豆科绿肥的根系分泌物）对固氮相关微生物群落的影响要大于土壤环境因子的变化。
我们进一步构建了固氮菌和AMF的共现网络，将共现网络划分为4个主要生态集群，并计算各生态集群中物种的系统发育特征。分析结果显示，长期CM和WS处理导致Module #1中固氮菌从系统发育随机到系统发育分散，表明这些固氮菌的遗传距离较远且存在较强的竞争排斥作用。Module #1中固氮菌系统发育变化表现在长期CM和WS处理下导致大量的富营养型固氮菌的出现，例如Methylocaldum、Methyloversatilis和Leptothrix，它们都属于β-变形杆菌纲。以上结果表明，大量的有机输入会导致具有相同营养特性的固氮菌竞争生态位和资源。然而，长期施肥导致Module #2中AMF从系统发育分散到系统发育随机，这一变化与Module #2中大量Kamienskia sp.、Septoglomus sp.和Glomus sp.的消亡密切相关。这些物种在本研究地点是否具有竞争资源的特性有待进一步研究，尽管如此，这一发现表明长期施肥改变了主导AMF菌群的生态过程，促使其在资源丰富的环境中实现共存。我们认为，在某些施肥制度下，这种种内竞争是导致土壤自生固氮活性较低的部分原因。
PLS-PM分析表明，长期施肥通过间接地增加关键生态集群Modules #0、降低Modules #2的相对丰度增加土壤自生固氮活性。这一发现表明，长期施肥通过定向选择某些特定固氮菌和AMF的生态集群来促进土壤自生固氮，而非整个微生物群落，这也支撑了本文的第二个科学猜想（H2）。在Modules #0中，兼性固氮菌 Skermanella 和 Azospirillum 作为优势菌，在所处环境营养丰富时，可以利用环境中养分快速生长，以往的研究认为富营养条件将会削弱此类固氮菌的固氮活性。然而我们的证据表明，Modules #0中的固氮菌在富营养环境下可能仍保持较高的自生固氮活性，这挑战了兼性固氮菌在营养丰富环境中降低固氮活性这一传统认知。这一现象可能因为，施肥导致的富营养环境通常为固氮微生物提供更多生态位（如较高的土壤容量）和缺氧环境（促进产生隔绝空气的团粒结构和促进土壤呼吸消耗形成局部无氧空间），这些在理论上均利于固氮菌自生固氮。
与Module #0不同，长期施肥导致Module #2中的固氮菌群相对丰度显著降低，且Module #2中的固氮菌群相对与土壤自生固氮活性显著线性负相关，说明Module #2中的固氮菌可能具有较低的固氮能力。在这方面，我们进一步发现长期施肥导致一系列固氮菌群消失，包括 Pseudacidovorax和Azohydromonas，而它们在长期不施肥条件下具有较高的相对丰度。这一结果有以下几个可能原因：1）虽然Pseudacidovorax 和 Azohydromonas 均属于β-变形杆菌纲（往往具有富营养特性），但是二者表现出寡营养类群的特征，先前也有研究报道，这些固氮菌往往在贫营养环境中富集；2）Module #2中的固氮菌可能具有较低的上调土壤自生固氮活性的能力，因为它们在不施肥处理下受到磷和碳的限制，Module #2中固氮菌与AMF之间具有更强协同关系的现象也支撑了这一观点。
越来越多的证据表明，AMF可以通过传输营养物质协助固氮菌进行生物固氮。近期一项研究表明，在森林生态系统中根际内固氮菌和AMF之间存在更多的协同而非拮抗关系，与我们的研究结果相似。虽然固氮菌与AMF之间往往存在正相关关系已被证实，但本研究发现这种关系也存在于非根际土壤中。值得关注的是，与AMF呈现协同关系的固氮菌的相对丰度与长期施肥呈负相关，表明在营养丰富的环境中固氮菌不在需要AMF的协同作用。这支撑了我们科学猜想H3，即长期施肥削弱固氮菌和AMF之间的协同关系。Modules #0和#2中固氮菌和AMF之间的关系提供了更直接的证据，其中生态集群Modules #0在有机施肥处理中富集，Modules #0中固氮菌和AMF有极少的协同关系；生态集群Modules #2在不施肥处理下富集，而Modules #2中的固氮菌和AMF存在较多的协同关系。然而，长期GM处理能够改善Module #0内固氮菌和AMF之间的协同关系，这可能是支持该处理具有最高的土壤自生固氮活性的另一重要原因。关联分析也表明，Module #0中与AMF存在协同关系的固氮菌相对丰度与土壤自生固氮活性显著正相关。
本研究虽然揭示了固氮菌与AMF构成的关键生态集群相对丰度对维持土壤自生固氮活性的重要性，但未通过构建特定的简易微生物组进行实验验证。另外，固氮菌和AMF之间的协同作用只是基于强正相关的关系，可能是假阳性的结果，不可作为可靠无误的证据。通过机器学习得到的网络分析，可能无法全面真实地描述环境中微生物之间的相互作用。然而，基于关联性构建的微生物网络结果对于预测复杂环境中潜在的物种相互关系或它们的功能仍然是至关重要的，也为未来微生物驱动土壤自生固氮研究提供了新的线索。
结 论
本研究挑战了长期施肥降低土壤自生固氮活性这一传统认知，即长期施肥（尤其种植利用绿肥）促进土壤自生固氮。土壤自生固氮活性与土壤固氮菌、丛枝菌根真菌丰度及二者共生网络中的关键生态集群Module #0（Skermanella、Azospirillum 和 Glomus 为主）高度相关。长期施肥（尤其有机施肥）抑制固氮菌与丛枝菌根真菌之间的协同关系，高肥力水平下土壤自生固氮过程可能不再依赖丛枝菌根真菌传输养分。有趣的是，长期种植利用绿肥加强了关键生态集群Module #0中固氮菌与丛枝菌根真菌之间的协同关系，这也支撑了种植利用绿肥下土壤具有较高的固氮活性。本文首次提供了种植利用绿肥内源驱动土壤自生固氮的证据，同时为研究土壤自生固氮与丛枝菌根真菌的关系提供新视角。
材料与方法
试验设计与样品采集
本研究选用位于甘肃省武威市凉州区（38°37′N，102°40′E，海拔1504 m）的小麦-玉米间作体系下的长期施肥试验（始于1988年）。该地区为典型温带大陆性气候，年平均蒸发量为2021 mm、年均气温7.7℃、年均降水量150 mm。土壤类型为灌漠土（国际土壤分类中的始成土），含砂粒36.9%、粉粒55.4%、黏粒8.8%，试验开始前pH为8.8。研究选取5个处理，每处理重复3次，随机区组排列，小区面积为6.9 × 4.5 m2。试验处理包括：CK，不施肥对照；CF，施用氮肥（375 kg N ha−1 a−1）；CM，施用牛厩肥（120000 kg ha−1 a−1）；WS，小麦秸秆还田（10500 kg ha−1 a−1）；GM，绿肥（45000 kg ha−1 a−1）。各处理除CK外，均施用磷肥，施用量为150 kg P2O5 ha−1 a−1。
于2020年小麦成熟期，采集0~20 cm土壤，新鲜土壤过2 mm筛后分3部分保存，分别为，20 g 土壤样品保存于−80°C用于DNA提取；80 g新鲜土壤样品用于矿质氮测定及土壤自生固氮活性分析；剩余土壤自然风干后用于土壤基础理化指标分析。
土壤理化性质分析
风干过0.25mm的土壤样品（约0.5 g）用1.0 mol L-1 HCl (20 ml)酸化以去除无机碳，然后用蒸馏水反复洗涤三至四次，直至pH升高至中性。上述步骤获得去除无机碳的土壤样品采用元素分析仪（GmbH VarioEL, Germany）测定有机碳（SOC）和全氮（TN）含量。采用HF-HClO4消解—钼蓝比色法测定土壤全磷含量。矿质氮（铵态氮和硝态氮）采用2 mol L-1 KCl提取（土水比1:10），连续流动分析仪测试（AA3, Germany）。0.5 mol L-1 NaHCO3提取土壤有效磷（AP），钼蓝比色法测定含量。pH采用电极法测定（水土比1:1）。长期不同施肥后土壤基础理化性质见表1。
表1. 长期不同施肥处理下土壤基础理化性状
注：括号内数据为±标准差，同一指标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。CK，不施肥；CF，化肥；CM，牛粪；WS，麦秸；GM，绿肥。SOC，土壤有机碳；TN，全氮；TP，全磷；AP，有效磷。
土壤自生固氮活性测定
我们采用15N-N2同位素示踪法测量土壤自生固氮活性。简单地说，称取2 g新鲜土壤于12 ml顶空瓶中，橡胶隔垫封口并用螺纹环盖固定，抽真空去除瓶内气体，立即用20% (v/v) O2和80% (v/v) 15N2 (99 atom % 15N)组成的合成气体填充，同时设置填充未标记N2的对照组，所有顶空瓶内气体均保持1个大气压，黑暗室温条件下培养22天。培养结束后，去掉瓶盖、冷冻干燥器内冻干、球磨仪研磨后测定土壤样品的15N丰度。土壤自生固氮活性的计算公式为：
BNF (μg N kg-1 d-1) = (15N atom% Soil – 15N atom% Soilcontrol) × TN)/T
式中，15N atom% Soil 和15N atom% Soilcontrol分别代表标记和未标记土壤处理的15N原子百分超；TN为培养后土壤全氮含量，T为培养时间（d）。
土壤DNA提取和荧光定量PCR（qPCR）分析
采用土壤DNA试剂盒（MP Bio, USA）从0.5 g土壤中提取总DNA。通过1%（wt/vol）凝胶电泳和Nanodrop 2000分光光度计（Thermo Fisher, Waltham, MA, USA）检测DNA浓度和质量。提取的DNA在100 μL洗脱缓冲液中洗脱，保存于-20℃环境中用于qPCR及高通量测序分析。
固氮菌nifH基因和丛枝菌根真菌18S rRNA 基因拷贝数采用qPCR测定，引物分别为：nifH-F/nifH-R （5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′/5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′） 和AMV4.5N-F/AMDG-R （5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′/5′-CCCAACTATCCCTATTAATCAT-3′），测试平台为Line-Gene 9600 Plus Real-time PCR system (Bioer, China)。qPCR反应物包括：5 μL ChamQ SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech Co., Ltd., China)，1 μL DNA模板，0.2 μL 前段引物 (10 μM), 0.2 μL 后端引物 (10 μM)和3.6 μL ddH2O。nifH 基因PCR反应条件为：95°C预变性5 min后，95°C变性15s，60°C退火30 s，72°C延伸40 s，循环40次；18S rRNA基因PCR反应条件为：95°C预变性5 min后，95°C变性10s，60°C退火30 s，72°C延伸40 s，循环40次。将分别携带nifH 和18S rRNA基因的重组质粒扩增成10倍稀释序列，建立标准曲线。标准曲线显示 nifH 基因和18S rRNA 基因的扩增效率分别为96.4% (R2 = 0.99) 和92.5% (R2 = 0.99)。
高通量测序及生物信息学分析
采用与qPCR相同的基因序列，分别对nifH 和18S rRNA 基因扩增。PCR反应体系包括：12.5 μL KAPA2G Robust HotStart ReadyMix PCR (KAPA biosystems), 1 μL前端引物（5μM），1 μL末端引物（5 μM），5 μL DNA模板（30 ng）和5.5 μL ddH2O。反应条件为：95°C预变性3 min后，95°C变性30s，55°C退火30 s，72°C延伸45 s，循环35次。进行三次PCR扩增并合并到每个样品中，PCR产物用Qiagen凝胶提取试剂盒进一步纯化。测序文库按照NEB Next Ultra II DNA Library Prep Kit (New England Biolabs, Inc., USA) 说明书操作生成，并以此采用Nanodrop 2000 (ThermoFisher Scientific, Inc., USA)、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., USA)和ABI StepOnePlus Real Time PCR System (Applied Biosystems, Inc., USA)评估所建文库质量。最后使用Illumina MiSeq PE300平台（北京奥维森公司）对文库进行配对端测序。下机原始固氮菌和丛枝菌根真菌序列已提交至NCBI SRP391822和SRP391816。
将测序获得的固氮菌和丛枝菌根真菌序列导入QIIME2软件进行下游分析。去除短序列（<200 bp）和质量比较低的序列（average scores < 20 reads）或者嵌合序列，获得高质量核苷酸序列。经过质量控制后，从所有固氮菌和丛枝菌根真菌样品中分别获得了885,340和1,952,575个高质量序列。随后，通过随机抽样每个样本到任何样本获得的最低序列数，对不同样本的序列数进行标准化，以考虑不同的测序深度。运用DADA2将有效序列聚类为扩增子序列变体（ASV），序列识别阈值为100%。在所有土壤样品中，我们分别获得了526和411个固氮菌和丛枝菌根真菌的ASVs。采用RDP classifier贝叶斯算法对固氮菌和丛枝菌根真菌的ASV代表序列进行分类学分析，比对的基因库分别为GeneBank和MaarjAM Glomeromycota数据库，并在各个水平统计每个样品的群落组成。为了避免不同样品间测序数量不同而引起的计算误差，应用Mothur（SCHLOSS et al., 2009）平台，依据所有样本的最小序列数，对各个样本做抽平处理。分类学分析显示，约96%的固氮菌序列和95%的丛枝菌根真菌序列可分别分为6个细菌门（变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿菌门、蓝菌门和疣微菌门）和2个真菌纲（球囊菌纲和蛙粪霉纲)。
微生物共现网络分析
通过R中的“WGCNA”包构建所有样本固氮菌和丛枝菌根真菌的共现网络，本研究重点关注了相对丰度大于0.01%的ASVs序列。将筛序后的固氮菌和丛枝菌根真菌ASVs表合并得到一个新的ASVs表，包含307个固氮菌ASVs和234个丛枝菌根真菌ASVs。基于 Spearman 相关性矩阵计算ASVs之间的所有配对相关性，并采用FDR矫正P值。我们删除相关系数小于 0.65，P 值大于 0.01 的相互关系，只关注共现网络中强烈共存的相互关系。利用“Gephi”(https://gephi.org/)软件中的默认参数对共存网络及生态集群进行可视化。总体网络共分为4个主要的生态集群，将各生态集群中包含的 ASVs的相对丰度进行标准化 (z-score) 后取平均值，由此得出各生态集群的相对丰度。在本研究中，如果生态集群的标准化相对丰度与土壤自生固氮活性之间具有显著关系，我们将生态集群视为关键生态集群。
统计分析
采用SAS 8.1软件中的单因素方差分析模块（One-way ANOVA）对不同处理之间的土壤性状、功能基因拷贝数、土壤自生固氮活性等指标进行显著性比较（Fisher’s LSD, P < 0.05），利用Wilcoxon rank-sum检验比较不同处理下土壤微生物α多样性差异，利用STAMP（v. 2.1.3）分析长期施肥后微生物相对丰度的统计学差异。使用Origin 2022评估了土壤性状、α多样性、微生物生态集群相对丰度和土壤自生固氮活性之间的所有配对Spearman相关性。置换多元方差分析（PERMANOVA）用以分析不同施肥处理对土壤微生物群落的影响，Mantel 检验用以分析土壤微生物群落与土壤理化性状之间的关系。基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA分析和Mantel检验的采用R软件中的“vegan”包进行。采用随机森林模型（R软件中“randomForest”包）对长期不同施肥处理中 ASVs的相对丰度（标准化系数）与土壤自生固氮活性进行回归分析，用来确定与土壤自生固氮活性密切相关的最佳ASVs组合。
利用系统发育随机性抽样理论（即随机性的从系统发育树上进行采样，将得到的系统发育多样性的数值作为预测值，然后将观察值与预测值进行比较）来确定哪些固氮菌和丛枝菌根真菌群落出现聚集 （<-2）、随机性分布（> − 2 或< 2）或过度扩散（> +2）。系统发育随机性抽样理论用 R 软件中的“picante”包进行计算。对局部的系统发育树进行随机性采样，其优势在于能基于二项采样模型比较不同样本量的系统发育多样性。通过计算和比较各生态集群的 z-score 值，确定系统发育多样性的观测值与预测值（期望）之间的差异。
利用R中的“plspm”包进行PLS-PM分析，用以评估土壤性质、固氮菌和丛枝菌根真菌群落以及二者的协同作用对土壤自生固氮活性的直接和间接影响。通过计算各因子对土壤自生固氮活性的交叉载荷效应来更好地解析 PLS-PM模型中土壤理化性质、固氮菌和丛枝菌根真菌群落及二者的协同作用对土壤自生固氮活性的影响。
引文格式：
Zhou, Guopeng, Kunkun Fan, Guilong Li, Songjuan Gao, Danna Chang, Ting Liang, Shun Li, et al. 2023. “Synergistic Effects of Diazotrophs and Arbuscular Mycorrhizal Fungi on Soil Biological Nitrogen Fixation After Three Decades of Fertilization.” iMeta. e81. https://doi.org/10.1002/imt2.81
作者简介
周国朋（第一作者）
● 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所博士后
● 目前研究方向为种植利用绿肥后的土壤养分循环、稻田温室气体排放与养分损失。主持国家自然科学基金青年基金项目、国家重点研发计划子任务。研究成果以第一作者在iMeta、Bioresource Technology、Biology and Fertility of Soils、Geoderma、Soil and Tillage Research等期刊发表学术论文11篇
曹卫东（通讯作者）
● 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所研究员，国家绿肥产业技术体系首席科学家，“十四五”国家重点研发计划项目“新型绿肥产品创制与产业化”项目负责人
● 研究方向：绿肥调控农田养分循环与节肥减排机制、“绿肥+”生态效应强化机制及调控产品创制、“绿肥+”高品质农产品路径与产业化、绿肥修复农田生态技术及产业化应用。曾获或省部级科技进步一、二等奖7项；第一发明人专利授权4项，主编著作6部，以第一作者及通讯作者身份发表论文100多篇。中国植物营养与肥料学会绿肥工作委员会主任委员、农业农村部科学施肥指导专家组成员
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第1卷第1期
第1卷第2期
第1卷第3期
第1卷第4期
期刊简介
“iMeta” 是由威立、肠菌分会和本领域数百位华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表原创研究、方法和综述以促进宏基因组学、微生物组和生物信息学发展。目标是发表前10%(IF > 15)的高影响力论文。期刊特色包括视频投稿、可重复分析、图片打磨、青年编委、前3年免出版费、50万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊发行！
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