快讯| Nature加速审稿的文章：Type II CRISPR–Cas整合机制
iNature：有趣的是，这篇Nature是加快审稿，提前online，估计还有其他研究组也在研究Cas1-Cas2的整合机制，说明了这个领域竞争相当激烈。RNA介导的CRISPR干扰机制在不同的CRISPR-Cas系统变化很大，但是spacer整合机制是完全一样的。为什么整合机制是一样的，这很让人费解。这一次，AiLong Ke课题组使用结构生物学的方法解决了这一难题。AiLong Ke课题组使用 Enterococcus faecalis Type II-A系统，解决了Cas1-Cas2整合的过程的结构。EfaCas1-Cas2选择性的结合30bp prespacer片段中的4nt 3’-悬挂端。一旦接触到底物，就会有三个分子事件发生：Cas1-Cas2/prespacer首先随机的搜索half-sites；然后优先的同leader链的CRISPR重复序列相互作用；之后就是亲和攻击反应，使 leader-最近的重复序列靠近prespacer 3’-悬挂末端。识别 spacer half-site 需要DNA的扭曲，导致可以完全的整合。因此，这也解释了多步骤的 spacer整合过程以及 leader-靠近的偏爱性现象。
CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated)适应性免疫系统大约有50％的细菌和90％的古菌存在着【1】。 这些系统的功能是与限制 - 修饰系统，防止噬菌体感染和保护原核生物群体免遭噬菌体侵染作用【2】。 与其他细胞防御机制不同，这种系统可以提供普遍保护，防止任何入侵者，CRISPR免疫功能类似于脊椎动物的适应性免疫作用一样，一段外源的短的DNA来源的 prespacer整合到CRISPR array中，成为一个新的spacer，就会产生分子记忆，之后相同的感染，就会快速的引起细菌对于感染的应答。
CRISPR-Cas系统一般被认为是一段基因序列，称之为CRISPR array，由一系列的20-50bp正向重复序列组成；中间有一段相似长度的且独特的spacers序列，在spacer之前有一段富含AT序列称之为‘‘leader’’ 序列【3-4】。在大肠杆菌中CRISPR基因座发现的大约20年以后，spacers在病毒的基因组，接合质粒中发现，这也再次记录了先前的感染作用【5-7】。能够匹配上spacers的外源DNA序列成为proto-spacers。
CRISPR免疫可以归为三个阶段：spacer序列的获得，CRISPR RNA (crRNA)生物学合成，产生干扰作用（Fig.1）【8-9】。在spacer获得的过程中，也就是所说的适应过程，外源的DNA被鉴定，加工，并整合到CRISPR基因座中成为新的spacer；crRNA生物学合成涉及CRISPR基因座的转录，经常是单链的称之为pre-crRNA，然后加工成成熟的crRNAs（包含单个spacer）；在干扰阶段，一个效应复合物使用crRNA鉴定及破坏携带同crRNA spacer序列互补的噬菌体或者是质粒。
Fig.1 CRISPR免疫发生过程
图片来源Doudna，Cell Review（2015）
那些步骤主要是由Cas蛋白来执行，由CRISPR arrays侧翼的Cas基因编码。不同的菌种间，cas基因变化很大。基于CRISPR-Cas中的特征性的基因，可以将其分为6类（Fig.2）【10-11】：类型I–III被研究的最为充分，而类型 IV–VI 最近才兴起【12】。CRISPR-Cas类型 I的特征性蛋白是Cas3，这个蛋白有核酸酶以及helicase结构域，功能是降解并断裂DNA，通过多蛋白-crRNA复合体的级联反应进行；在类型II 系统中，特征性的蛋白是cas9 ，对于最后的干扰作用，只需要Cas9；类型 III 是以Cas10为特征，它可以组装到Cascade-like干扰复合物中，进而靶向目的片段；类型IV系统有 Csf1，被认为是Cascade-like复合物中的一个成分，没有典型的结构域分布，虽然这些系统从cas基因里被发现，但是这个系统没有 CRISPR array；类型V包含一个Cas9样的核酸酶，可分为Cpf1,C2c1, C2c3亚类【13-14】；类型VI系统有C2c2蛋白，它拥有俩个预测的HEPN RNase结构域。类型 I, III, 及 IV 被认为是Class 1 系统，是基于多亚基效应复合物，而类型 II, V, 及 VI 系统归为 Class 2，那是基于单亚基效应物。
Fig.2 CRISPR-Cas分类
图片来源Doudna，Cell Review（2015）
虽然RNA介导的CRISPR干扰机制在不同的CRISPR-Cas系统变化很大，但是spacer整合机制是完全一样的【15-16】。保守的Cas1 及 Cas2可以形成整合酶复合体（由2个Cas1及2个Cas2组成）。Cas1-Cas2结合 prespacer，进而形成双叉DNA，在整合过程中，3‘端的悬挂碱基的 3’-OH作为去攻击亲和基团，重要的是，prespacer偏爱整合到靠近CRISPR array附近，主要由leader sequence及配对的反向重复序列（IR）来指引这种整合作用。在研究的非常好的大肠杆菌中的Type I-E CRISPR系统，Spacer整合作用主要依赖于细菌的整合宿主因子（IHF）【17-18】；在 Type II-A CRISPR中，在体外仅仅需要 Cas1-Cas2就能有效的整合形成spacer；另一些Cas蛋白(Cas9 及Csn2)在prespacer生物学的合成中起到了辅助作用。
Fig.3 Cas1-Cas2,DNA复合体结构
虽然Cas1-Cas2在体外的一些整合作用很清晰，但是一直没有精确的结构来阐述其中的具体机制，使其中的一些问题还是处于开放状态，始终得不到解决。在这里，AiLong Ke课题组使用 Enterococcus faecalis Type II-A系统，解决了Cas1-Cas2整合的过程的结构(Fig.3)。EfaCas1-Cas2选择性的结合30bp prespacer片段中的4nt 3’-悬挂端。一旦接触到底物，就会有三个分子事件发生：Cas1-Cas2/prespacer首先随机的搜索half-sites；然后优先的同leader链的CRISPR重复序列相互作用；之后就是亲和攻击反应，使 leader-最近的重复序列靠近prespacer 3’-悬挂末端。识别 spacer half-site 需要DNA的扭曲，导致可以完全的整合。
因此，这篇文章解释了多步骤的 spacer整合过程以及 leader-靠近的偏爱性现象。
英文链接
http://www.nature.com/nature/journal/vaap/ncurrent/full/nature24020.html
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