10项主导生命科学领域发展的技术（一）

iNature：经过iNature编辑组整理了历年的诺贝尔自然学奖（包括物理学奖，化学奖，生理医学奖）及最新的科研进展，遴选出了10项改变了全球生命科学领域的技术，这10项技术分别是：X射线的发现及应用，DNA是遗传物质,测序方法的发明及应用（包括DNA及蛋白质测序）,PCR技术的诞生,基因操作技术（包括CRIPSR及RNAi）,显微镜的出现及应用，色谱技术的发展及应用，分子克隆技术，重编程技术（iPS及相关），蛋白的标记技术（尤其是GFP标记）。

突破性技术

1.X射线的发现及应用

1895年11月8日伦琴发现了X射线，为开创医疗影像技术铺平了道路 ，于1901年获得了首个诺贝尔物理学奖。这一发现不仅极大的推动了医疗方面，而且因为这个，Henri Becquerel 及居里夫妇发现了天然放射性现象，他们于1903年获得了诺贝尔物理学奖。

第一张X射线图片

但是，X射线是怎么样同生命科学联系在一起的呢？这主要由三位学者做了奠基性的工作。在1912年，德国物理学奖Max von Laue发现了晶体的X射线衍射现象，这是固体物理学中具有里程碑意义的发现，从此，人们可以通过观察衍射花纹研究晶体的微观结构，并且对生物学、化学、材料科学的发展都起到了巨大的推动作用，因为这个，Laue在1914年获得了诺贝尔物理学奖。

Max von Laue

虽然Laue发现了X射线衍射现象，但是并没有提出怎么去解析晶体结构。这方面，这要是由Lawrence Bragg及William Bragg共同解决，他们通过对X射线谱的研究，提出晶体衍射理论，建立了布拉格公式，并改进了X射线分光计，他们于1915年获得诺贝尔物理学奖，这为后面的结构学奠定了基础。

Lawrence Bragg

后面基于蛋白纯化技术的提高，Max F. Perutz及John Kendrew解析了肌球蛋白及肌红蛋白，他们于1962年获得诺贝尔化学奖。还有很多都是关于蛋白结构的解析，如核糖体结构的解析以及RNA聚合酶的解析，都是使用类似的方法，X射线晶体衍射方法在结构学方面起了举足轻重的作用，现在也是很常规的方法。

2.DNA是遗传物质

Kossel分离并描述了存在于核酸中的五种有机化合物：腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶。 这些化合物后来显示为核碱基，并且是所有活细胞中发现的DNA和RNA的形成的关键。因为这些工作，Kossel获得了1910年的诺贝尔生理医学奖。

A，T，C，G，U五种碱基

但是，Kossel虽然发现了这些东西，人们对于什么是遗传物质一直争论不休，有的人认为是DNA，而另一些人认为是蛋白质，更有甚者，认为糖类是遗传物质。

噬菌体感染实验

Hershey及Chase通过噬菌体感染实验，证明DNA是遗传物质，而糖类，蛋白质及RNA都不是遗传物质，基于这Hershey与1969年获得诺贝尔生理医学奖，很遗憾，Chase没有获得，可能是因为Chase是一位女性，而没有得到诺贝尔奖委员会的青睐，非常的可惜。

Rosalind Franklin及DNA衍射图

正是基于这项实验，导致了大家对于DNA的进一步的研究热潮，尤其是Maurice Wilkins和Rosalind Franklin（1958年，由于卵巢癌去世，错失诺贝尔生理医学奖）使用X射线晶体衍射方法，获得了DNA的原始结构，而后由James Watson和Francis Crick观察了衍射图，他们才提出DNA的双螺旋结构。

DNA双螺旋结构

之后，Watson和Francis Crick提出了DNA双螺旋模式：一种核酸的构象，在该构象中，两条反向平行的多核甘酸链相互缠绕形成一个右手的双螺旋结构。碱基位于双螺旋内侧，磷酸与糖基在外侧，通过磷酸二脂键相连，形成核酸的骨架。碱基平面与假象的中心轴垂直，糖环平面则与轴平行，两条链皆为右手螺旋。双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm， 两核甘酸之间的夹角是36゜，每对螺旋由10对碱基组成，碱基按A-T，G-C配对互补，彼此以氢键相联系。维持DNA双螺旋结构的稳定的力主要是碱基堆积力。双螺旋表面有两条宽窄`深浅不一的一个大沟和一个小沟。

中心法则

紧接着，在1958年，Francis Crick提出了中心法则，这是在细胞内的生物大分子间转移的基本法则，指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)是对中心法则的补充。正是因为以上的贡献，到1962年，Maurice Wilkins，Watson和Francis Crick共同获得诺贝尔生理医学奖。

3.测序方法的发明及应用

测序方法主要涉及蛋白质测序及DNA测序，其中蛋白质测序是由Frederick Sanger 开发完成的，第一个测出了胰岛素的氨基酸序列，这项成果于1958年获得诺贝尔化学奖。Sanger使用了来自剑桥大学化学系的Bernhard Charles Saunders的有毒气体研究的化学试剂1-氟-2,4-二硝基苯（现称Sanger试剂，氟二硝基苯，FDNB或DNFB）。

Frederick Sanger

Sanger试剂证明在多肽链一端标记N末端氨基有效。然后，他用盐酸或使用酶如胰蛋白酶将胰岛素部分水解成短肽。将肽的混合物在一张滤纸上二维分馏，首先通过一维电泳，然后垂直于另一个色谱法。用茚三酮检测到的胰岛素的不同肽片段移动到纸上的不同位置，形成了Sanger称为“指纹”的不同图案。通过FDNB标记赋予的黄色可以识别来自N末端的肽，并且通过完全酸水解确定在肽末端标记的氨基酸的特性，并发现哪一个二硝基苯基 - 氨基酸在那里。

胰岛素结构

通过重复这种类型的程序，Sanger能够确定使用不同的初始部分水解方法产生的许多肽的序列。然后可以将它们组装成更长的序列，以推断胰岛素的完整结构。最后，由于A和B链在没有三个连接二硫键（两个链间，一个在A上的一个链内）是生理上无活性的，Sanger和他们的同事在1955年确定了它们的完整结构。Sanger的主要结论是蛋白质胰岛素的两条多肽链具有精确的氨基酸序列，并且通过延伸，每种蛋白质都具有独特的序列。正是这一成就在1958年获得了他的第一个诺贝尔化学奖。这个发现对于Crick的后续序列假说来说，对于DNA编码蛋白质的思想来说是至关重要的。

Sanger测序方法（双脱氧核苷酸终止法）

DNA测序主要是由Frederick Sanger及Walter Gilbert 共同作出了奠基性的贡献，他们于1980年获得诺贝尔化学奖。Frederick Sanger提出了Sanger sequence的方法，也就是双脱氧核苷酸终止法，现在是主流的方法，应用于各种各样的测序中，视为测序的金标准。Sanger首先使用这种方法测出了bacteriophage φX174的基因组结构，幸好这物种的基因组不大，否则Sanger也不会选择这个进行测序。

bacteriophage φX174基因组

Maxam-Gilbert测序是由Allan Maxam和Walter Gilbert在1976 - 1977年开发的DNA测序方法。 该方法基于DNA的核碱基特异性部分化学修饰，并随后在与修饰的核苷酸相邻的位点断裂DNA主链，完成测序。

Maxam-Gilbert测序

Maxam-Gilbert测序，也称为化学测序，该方法允许使用纯化的双链DNA样品，无需进一步克隆。 该方法使用放射性标记及其技术复杂性阻碍了其进一步大规模的应用，而Sanger方法经过改进后，得到了广泛使用。

4.PCR技术的诞生

提到PCR技术，学习生命科学的，没有人不会不知道。我们进行PCR反应，Taq DNA聚合酶及PCR仪必不可少。故在这里主要介绍这俩个概念。Taq聚合酶是一种热稳定的DNA聚合酶，是一种为嗜热菌（Thermus aquaticus），最初被我国台湾学者钱嘉韵等人从其中分离出来，这是一种大量扩增DNA短链数量的方法。

T. aquaticus是一种住在温泉和热液喷口的细菌，Taq聚合酶被鉴定为能够耐受PCR期间所需的蛋白质变性条件（高温）的酶。因此，它取代了原始用于PCR的大肠杆菌的DNA聚合酶。Taq的最佳活性温度为75-80℃，在92.5℃下半衰期大于2小时，95℃为40分钟，在97.5℃为9分钟，可以复制1000bp DNA在72℃不到10秒钟。Taq的缺点之一是缺乏3'至5'核酸外切酶校正活性，导致复制保真度相对较低。原来其误差率在9,000个核苷酸中约为1。

Taq DNA聚合酶结合DNA

现在已经从具有校正活性的其他嗜热细菌和古细菌如Pfu DNA聚合酶中分离出一些热稳定的DNA聚合酶，并且正在使用（或与Taq组合）用于高保真扩增。Taq使具有A（腺嘌呤）的DNA产物在其3'末端突出。这可能在TA克隆中有用，由此使用具有T（胸腺嘧啶）3'突出端的克隆载体（例如质粒），其与PCR产物的A突出端互补，从而使PCR产物连接到质粒载体。

在20世纪80年代初，Kary Mullis在Cetus公司工作，将合成DNA应用于生物技术。他熟悉使用DNA寡核苷酸作为结合目标DNA链的探针，以及它们用作DNA测序和cDNA合成的引物。 1983年，他开始使用两个引物，一个与靶DNA的每条链杂交，并向反应中加入DNA聚合酶。这导致指数型DNA复制，大大扩大了引物之间的DNA量。

PCR反应原理

然而，在每一轮复制后，需要将混合物加热至90℃以上以使新形成的DNA变性，从而允许链条在下一轮扩增中分离并作为模板。该加热步骤还使得在发现Taq聚合酶（来自大肠杆菌的DNA聚合酶I的Klenow片段）之前使用的DNA聚合酶失活。使用热稳定的Taq可以在高温（〜60°C及以上）条件下进行PCR，这有助于引物的高特异性，并降低非特异性产物如引物二聚体的产生。此外，使用热稳定聚合酶消除了对每轮热循环添加新酶的需要。在相对简单的机器中的单个封闭管可用于执行整个过程。因此，使用Taq聚合酶是使PCR适用于有关DNA分析的各种分子生物学问题的关键所在。

PCR程序图

Hoffmann-La Roche最终以3.33亿美元从Cetus购买了PCR和Taq专利， 1989年，“科学”杂志将Taq聚合酶命名为“年度最佳分子”。 Kary Mullis在1993年获得诺贝尔化学奖。到20世纪90年代初期，Taq聚合酶的PCR技术被广泛应用于许多领域，包括基础分子生物学研究，临床检测和取证。它也开始在艾滋病毒直接检测艾滋病毒方面找到紧迫的应用。

5.基因操作技术（包括及RNAi及CRISPR）

RNA干扰（RNAi）是通过降解目标mRNA分子来抑制基因表达或翻译生过程。Andrew Fire和Craig C. Mello在1998年发表了线虫干细胞的干扰工作，他们于2006年共同分享了诺贝尔生理医学奖。

植物中的RNAi

但是不得不提，RNAi在植物里面更早的被发现，这也说明诺贝尔奖委员会有时候也不一定会注意到最原创的东西。 RNAi现在被称为精确，有效，稳定和优于用于基因抑制的反义技术。

RNA干扰

microRNA与siRNA- 是RNA干扰的核心。 RNA是基因的直接产物，这些小RNA可以结合其他特定的信使RNA（mRNA）分子，并且增加或减少其活性，例如通过防止mRNA被翻译成蛋白质。 RNA干扰在防御细胞对寄生核苷酸序列（病毒和转座子）中起重要作用。

动植物RNA干扰的区别

RNAi途径存在于许多真核生物中，包括动物及植物，并由Dicer酶引发，Dicer将长双链RNA（dsRNA）分子切割成约20个核苷酸siRNA的短双链片段。研究最多的是转录后基因沉默，当引导链与信使RNA分子中的互补序列相互对应并且通过Argonaute 2（Ago2）（RISC复合物的催化成分）诱导切割时，发生转录后基因沉默。在一些生物体中，尽管siRNA的摩尔浓度最初是有限的，但是该方法系统地传播。

RNAi应用

RNAi是细胞培养和活生物体中有价值的研究工具，因为引入细胞的合成dsRNA可以选择性地并且强有力地诱导抑制感兴趣的特定基因。 RNAi可用于大规模筛选，系统地关闭细胞中的每个基因，这可以帮助鉴定特定细胞过程所需的组分或诸如细胞分裂的事件。该途径也被用作生物技术，医药和杀虫剂的实用工具。

虽然RNAi应用简便，但是RNAi始终是在RNA水平上进行操作的，有时候经过几代遗传，RNA干扰的效果不会很好，另外，RANi干扰只是knockdown基因的表达，而没有达到knockout的程度，故也限制了RNAi的进一步应用。现在，出现了一种更powerful的技术，叫做CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术。

CRISPR组成成分

CRISPR包含已经攻击细菌的病毒的DNA片断。这些片段被细菌使用以通过类似病毒检测和破坏进一步攻击的DNA。这些序列在细菌防御系统中起着关键作用，并且构成了称为CRISPR / Cas9的基因组编辑技术的基础，其允许生物体内的基因永久修饰。

CRISPR种类

CRISPR / Cas系统的简单版本CRISPR / Cas9已被修改为编辑基因组。通过将与合成指导RNA（gRNA）复合的Cas9核酸酶转移到细胞中，可以在期望的位置切割细胞的基因组，从而允许去除和/或添加碱基，进而执行相应的基因编辑功能。

CRISPR应用

CRISPR / Cas基因组编辑技术有许多潜在的应用，已经在动物，植物，真菌等各个物种进行了应用，但是对于人类而言，还存在着伦理学问题，以及需要进一步解决脱靶效应等问题，才能进一步用在临床方面。

其实，RNAi与CRISPR技术相辅相成，使用CRISPR有时会遇到致死的问题，故只能使用RNAI，只需要使基因表达下调就可以了；但是有时候，对于RNAi出现的问题，CRISPR又可以解决，如knockout基因，遗传性问题。

后面5项技术，会在近期继续介绍，敬请关注。

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