Cell|剪切复合体结构的重大突破（最详细的剪接过程解析，以后再也不怕施一公的文章看不懂了，值得收藏）

iNature：剪接体是一种高度动态的大分子复合物，能够精确地从前体mRNA中切除内含子。在这里，Stark等研究组报告3.4埃分辨率的人类剪接体的冷冻电镜三维结构。在Bact状态下，剪接体被激活但不被催化引发，从而在剪接的第一个催化步骤之前功能性地被阻断。剪接体核心与酵母Bact剪接体相似;重要的差异包括存在RNA水解酶和肽基脯氨酰异构酶。为了检查纯化的剪接体的总体动态行为，Stark等研究组开发了基于主成分分析的方：Stark等研究组提炼到更高的分辨率，揭示了八个主要的构象状态；这八个状态之间高度灵活的结构组分之间的构象差异揭示了剪接体组分如何进行有序的组装，从而使其产生随后的催化活化所需的动态作用网络。

前体mRNA剪接是由剪接体催化的，剪接体是一种高度动态和复杂的分子机器，它含有前体mRNA，U1，U2，U4 / U6和U5 snRNPs以及许多非snRNP蛋白。 U1和U2 snRNP分别与内含子的5'剪接位点（ss）和分支位点（BS）相互作用，同时为U4 / U6.U5 tri-snRNP的稳定整合铺平了道路，产生了剪接体B复合物。然而，尽管tri-snRNP引入了必需的催化组分，但是剪接体B复合物仍然需要转化成催化活性复合物，这一过程需要广泛的结构重排。通过解开U4 snRNA的U4 / U6双链体（通过RNA解旋酶Brr2）启动活化， U6随后与U2（U2 / U6螺旋Ia和螺旋Ib）以及内部茎环（U6 ISL）自由地形成短双链体。最终在剪接体激活期间建立的催化RNA-RNA网络与II组自我剪接内含子的催化核心非常相似。随后通过RNA解旋酶PRP2将所得的活化的但是预催化的B（Bact）复合物转化为催化剪接体（命名为B *）。在人类中，B-to-B *转换也需要AQR RNA解旋酶的ATP酶活性，这在酵母酿酒酵母的剪接体中是不存在的。这表明人类剪接体中催化活化所需的构象重排比酵母中的那些更复杂。 B *复合物催化剪切的第一步，产生切割的5'外显子和内含子3'外显子套索中间体，产生剪接体C复合物。额外的RNP重排将C复合物转化为C *复合物，然后催化第二步剪接，并且5'和3'外显子的连接形成mRNA并释放内含子作为套索。

剪切过程

尽管酵母和人剪接体共享一组进化保守的核心剪接体蛋白，但是人剪接体蛋白通常含有具备未结构化的其他区域。人类中的剪接体还含有在酿酒酵母中不存在的许多其他蛋白质。纯化的剪接体的蛋白质组成是高度动态的，在B-to-Bact转换期间释放约30种蛋白质，包括U4 / U6特异性蛋白质，LSm蛋白质和所谓的B特异性蛋白质。在高等真核生物（包括PRP19 / CDC5L复合物的蛋白质和所谓的PRP19相关蛋白质中，至少35种蛋白质被募集或稳定地整合到高等真核生物中。人PRP19 / CDC5L复合体的酵母等同物NTC对于剪接体激活是关键的，NTC蛋白质在活化期间以及在晚期阶段稳定剪接体的RNA网络。在剪接体活化过程中需要几种额外的Bact蛋白;在人类中，这些必需蛋白质中的一些不存在于酵母Bact复合物中，例如大多数肽基 - 脯氨酰异构酶。

剪切形成的详细过程

最近，已经通过单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）以允许原子模型构建的分辨率确定了来自酵母和人的几种结构的剪接体复合物：tri-snRNP，B复合物，Bact复合物，C ，C * - 复合物，ILS-复合物。所报道的分辨率水平通常不是均匀的，而是在整个剪接体中显著变化。在所有可用的结构中剪接体的最佳解析的结构部分主要由U5snRNP组分和包含RNA和蛋白质组分的明确且稳定的催化U2 / U6RNP核心组成。相比之下，更周边的区域通常以较低的分辨率级别来确定。这反映了在剪接体装配过程中许多重塑步骤所需的剪接体的高度动态性质，其中大量组分需要调整它们的结合强度和它们与剪接体的结合相互作用以实现所需的重排。例如，在催化活化过程中，BRR2从它在tri-snRNP上的结合位点的〜250位置重新定位到其在剪接体中的位点。 U2核心可以看到类似的重排，在Bact-to-C转变过程中移动175。这种重排需要许多剪接体组分间非常动态的相互作用，以及这些组分在剪接体装配期间的协调动态行为。

8个状态的分类

最重要的是，观察到的运动必须保持在最严格的控制下，以保证剪接体的形成和功能;尽管如此，直到现在，剪接体如何控制这些任务仍然是完全未知的。实际上，研究3D结构确定的这种特别动态的行为是一个主要的技术挑战，因为移动结构部件通常在计算的3D结构中定义得不好。一些高度可移动的部分甚至完全没有3D密度图，在精制的密度图中，大约三分之一的剪切体复合物是不可见的。

人类Bact详细的核心结构

这种广泛的剪接体构象变异几乎肯定是其功能的关键。因此，Stark等研究组最初以高分辨率确定了人类剪切体的结构。随后，Stark等研究组通过将迭代3D分类方法与基于三维主成分分析（3D PCA）的新开发方法相结合，定量地解决了动态结构变化。经过广泛的三维分类，Stark等研究组获得了> 100个剪接体结构，根据它们的构象相似性，通过应用PCA变得有序。因此Stark等研究组能够确定构象景观中柔性组分的运动模式，并描述剪接体移动部分的运动的关键模式，其几乎完全覆盖由许多主要和次要构象状态组成的构象连续体。

构象改变

计数每个观察到的构象的粒子数甚至允许构象状态转化为能量状态（根据玻尔兹曼（Boltzmann）），其定量描述由剪接体采样的动态构象状态之间的低能障碍。通过应用PCA，剪接体的所有构象在构象相似性方面变得有序，这表明剪接体组装方向上的进展，发生在沿着第一特征向量的能量景观上从左到右。

动态结构

然而，重要的是要强调，这并不意味着剪接体以一种有序的方式严格地经历这些构象转换，尽管它们在相同的方向上变得越来越相似于后来的剪接体状态。重要的是，各状态之间的低能量障碍使装配路径具有随机性。这意味着一个独特的装配通路不存在，因为通过沿着能量景观“采样”任何主要和次要状态，可以发生剪接体形成。关键的是，这些不同结构的PCA分析显示，在活性剪接体形成期间的生产性进展需要许多蛋白质和RNA相互作用被准确地微调，并且通常以高度协调的方式，以使功能相关蛋白质组分稳定的结构调节。

整体构象变化与催化中心附近的核苷酸翻转结构

只有剪接体组成性质和取样运动能力的有效相互作用允许稳定结合和调节形成催化功能剪接体所需的蛋白质组分。因此，Stark等研究组的数据揭示了如何以及为什么剪接体的整体构象是形成催化活性复合物所需的。

原文链接

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30047-3

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