Cell|重大突破，CRISPR技术的再一次升级应用，通过表观遗传操作，逆转神经性疾病

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iNature：美国Whitehead研究所Jaenisch等研究组在Cell杂志上发表了题为“Rescue of Fragile X Syndrome Neurons by DNA Methylation Editing of the FMR1 Gene”的研究论文，该研究论文通过通过dCas9-Tet1 /单链导向RNA（sgRNA）使FMR1启动子的异染色质状态切换至活化染色质状态，恢复FXS（脆性X综合征） iPSC中FMR1的持续表达。这给脆性X综合征提供了一种新的策略。这也是首次使用CRISPR技术，在表观遗传层面上恢复一个基因，这对于后续的其他遗传疾病提供了一个范例。

脆性X综合征（FXS）是智力缺陷最常见的遗传疾病，发病率为3,600人中的一人。 FXS患者表现出广泛的自闭症表型，如智力，认知和社会缺陷。 这些缺陷归因于大脑发育过程中，由FMR1基因编码的脆性X智力低下蛋白（FMRP）的丢失。 FMRP是神经元中的RNA结合蛋白，并且已经显示其在发育中的突触处是局部蛋白质合成的分子制动器，因此对于维持正常的突触可塑性是必需的。  事实上，患者来源的神经元中FMRP表达的缺失导致神经递质受体和离子通道的放松失调节，引起突触超级兴奋性，进而影响中枢神经系统中各种神经回路的功能。

在FMR1的5’UTR处伴有CGG三核苷酸重复（> 200）扩增突变DNA超甲基化，被认为导致FMR1启动子处的异染色质形成，并随后沉默FXS中的FMR1表达，但是分子机制尚未完全了解。

目前，FXS疾病没有被治愈过的报道，可能是因为在分子和细胞水平缺乏对FXS病理生理学的理解以及FXS神经元环路的巨大复杂性。将CGG重复序列插入小鼠Fmr1基因座中不会导致DNA超甲基化或抑制Fmr1表达。尽管Fmr1敲除（KO）小鼠部分地重现了大脑中的神经元过度兴奋性，但FXS小鼠模型既不包含准确的遗传背景，也不完全概述FXS患者的表型。据报道，来源于FXS患者的胚胎干细胞（ESC）和诱导多能干细胞（iPSC）正确地模拟了CGG重复序列的超甲基化和FMR1的沉默，这是研究FXS的有用和补充工具。

为哺乳动物基因组中的基因编辑开发的CRISPR / Cas9系统已被用于纠正致病突变。 已经使用类似的基因编辑方法来缩短5’UTR处的CGG三核苷酸重复，以部分恢复FMR1表达，并使FXS患者衍生细胞的生理功能正常化，为涉及FMR1再激活的靶向治疗提供了原理证据。 此外，5-aza-2-脱氧胞苷治疗，抑制多梳抑制复合物和其他分子干预转录调控已显示部分恢复患者成纤维细胞中的FMR1，表明表观遗传调控在FMR1沉默在FXS中起主要作用。

为了剖析人类基因组DNA甲基化事件的功能意义，Jaenisch等研究组通过将催化灭活的Cas9与DNA甲基化修饰酶Dnmt或Tet（dCas9-Dnmt / Tet）融合，设计了DNA甲基化编辑工具，允许在哺乳动物基因组中进行有针对性对DNA甲基化进行编辑。在本研究中，Jaenisch等研究组应用该工具在多个FXS患者衍生的iPSC中的FMR1基因座上逆转CGG重复的超甲基化。

整个课题的设计思路

Jaenisch等研究组设计了一个单一的向导RNA（sgRNA）来指导dCas9-Tet1在病理性FMR1基因座中，有效去甲基化CGG重复序列。 CGG扩增的完全去甲基化诱导CpG岛的低甲基化，增加组蛋白H3赖氨酸27（H3K27）乙酰化和H3K4三甲基化，降低FMR1启动子处的H3K9三甲基化，并且解锁FMR1基因的表观遗传沉默，恢复FXS iPSC中的FMRP表达，更重要的是，该技术没有显着的脱靶效应。表观遗传学修复回复了FXS神经元的电生理异常，FMR1的重新激活在移植到小鼠脑中可以被维持。Jaenisch等研究组的研究提供了通过表观基因组编辑逆转基因失活可能是涉及表观遗传沉默的疾病的有效治疗策略的概念证明。

原文链接

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(18)30049-7

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