重磅|3大CRISPR顶级大牛（张锋等人）发表5篇综述，阐述CRISPR机理及应用（满满的干货，值得收藏）

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iNature：CRISPR-Cas作为一种基因组工程学工具引起了很多关注，该工具已经彻底改变了生命科学，并因其在生物技术，农业和医学领域的潜在转化应用而被认可。现在CRISPR领域开山人物Charpentier（在Cell上），Doudna（Cell及Annual Reviews上）张锋（在2篇Cell上）等人发表了5篇对于CRISPR系统介绍。慢慢的干货，值得收藏。现在iNature编辑组简单的介绍一下这5篇综述，重点是张锋的那2篇。

Charpentier的CRISPR系统总结

2018年3月9日， Emmanuelle Charpentier研究组在Cell发表题为“The Biology of CRISPR-Cas: Backward and Forward”的综述，该综述我们回顾了多种CRISPR-Cas系统的生物学特征，以及近年来在理解CRISPR-Cas免疫的三个阶段（适应，crRNA生物发生和干扰）的潜在机制方面取得的重大进展。 还讨论了CRISPR-Cas在噬菌体感染情况下的生态学和调控，这些系统在免疫领域的作用以及推动该领域前进的开放性问题。

近年来，CRISPR-Cas作为一种基因组工程学工具引起了很多关注，该工具已经彻底改变了生命科学，并因其在生物技术，农业和医学领域的潜在转化应用而被认可。然而，本综述的重点是CRISPR-Cas系统的生物学特性和理解基本机制的最新进展。除了概述CRISPR-Cas介导的各种类型和亚型免疫的共同主题之外， Charpentier还强调了这些系统中蛋白质和机制的多样性。首先介绍干扰，然后是之前的过程，许可免疫的最后阶段。这些免疫系统在噬菌体 - 原核生物相互作用的生态学中的作用以及噬菌体已经发展起来的对抗CRISPR-Cas的策略得到解决。最后， Emmanuelle Charpentier还讨论了CRISPR-Cas的规定，这些系统在豁免以外的作用以及该领域的其他新兴主题。

原文链接：

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31383-1

Dounda的CRISPR系统总结（2篇）

（1）CRISPR系统的结构及机制

这篇综述旨在提供对Cas9介导的RNA指导的DNA靶向和切割的深入的机制和结构性理解。来自生物化学和结构研究的分子见解为旨在改变催化功能，指导RNA特异性和PAM需求以及减少针对基于Cas9的针对遗传疾病的疗法的开发的脱靶活性的合理工程提供了框架。

广泛的结构研究揭示了Cas9介导的PAM识别和靶DNA结合和切割的分子机制，开始解释Cas9如何具有使其成为如此强大的基因组编辑工具（高效率和特异性）。尽管在知识方面取得了这些进展，但控制Cas9识别DNA靶标的精确性和准确性的因素以及防止不需要的脱靶切割的机制尚未完全了解。值得注意的是，尽管DNA的甲基化状态似乎对Cas9靶向和切割没有影响，但最近的研究表明DNA靶向可及性主要受染色质结构影响。此外，关于靶DNA解旋的单分子研究将继续有助于我们理解CRISPR-Cas9系统的靶向和切割活性的详细机制。还预计Cas9介导的基因组工程将会在很大程度上扩大Cas9直向同源物的识别和特征。总的来说，最近的结构和机理研究不仅提供了对CRISPR-Cas9机制的基本理解，而且还提供了基于结构的合理设计的框架，旨在改善CRISPR-Cas9效率并最小化对人类健康和治疗的脱靶效应。

原文链接：

https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-biophys-062215-010822

（2）CRISPR系统的应用及生物学机理

细菌和古细菌具有防御质粒和病毒感染的一系列机制。其中独特 的是CRISPR-Cas系统，其提供对外来核酸的适应性免疫作用。 CRISPR系统通过获取入侵者的基因记录来发挥作用。 在这篇评论中，Doudna等人讨论了最近在理解Cas蛋白质多样性方面的进展及响应外源核酸的机制；这些系统是如何在大量的生物体中，被用于精确的基因组操作。

原文链接：

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(15)01699-2

张锋的CRISPR系统总结（2篇）

CRISPR系统可以被分为2大类：类型1的CRISPR-Cas系统的特征是由多个亚基组成的效应子模块。类型1系统包含在细菌和古细菌中鉴定的所有CRISPR-Cas基因座的约90％，并且可以靶向DNA和RNA；第2类CRISPR-Cas系统的特征是由单个大的多结构域蛋白组成的效应子模块，这些蛋白似乎来源于可移动的遗传元件。 一些第2类效应蛋白，如Cas9和Cas12a（Cpf1）已成功用于基因组工程。

（1）类型1的CRISPR-Cas系统

分类:原核生物的CRISPR-Cas适应性免疫系统根据效应子模块组织分为两个不同的类别。 1类CRISPR-Cas系统利用多蛋白效应复合物，而2类CRISPR-Cas系统利用单一蛋白效应器。主要基于不同的效应蛋白家族，1类系统分为3种类型和12种亚型。 1类系统代表CRISPR-Cas基因座的约90％，并且存在于不同的细菌和古菌门中;嗜热菌富含III型系统。除效应子基因之外，大部分1类基因座编码适应模块蛋白质Cas1和Cas2，以及多种辅助蛋白质，例如Cas4，逆转录酶，CARF（CRISPR相关的Rossmann折叠）结构域蛋白质等。 III型和IV型系统在其各自的基因座中经常缺少适应性模块基因和/或CRISPR阵列。所有I型系统也编码DNA解旋酶Cas3，其通常与HD家族核酸酶结构域融合。在I型系统中，PAM在不同亚型之间变化，位于（原型）间隔区的5'或3'，对于适应和干扰都是必需的。

作用机制：在适应过程中，通过CRISPR系统获得新的免疫记忆的过程需要Cas1和Cas2蛋白; Cas1的核酸酶活性，但不是Cas2的核酸酶活性，是至关重要的。此外，Cas3，Cas4和效应复合体在适应中的参与已经被证明用于I型系统。对于一些III-B系统，已经证明了在这个过程中获得源自RNA的间隔区和与Cas1蛋白融合的逆转录酶的作用。 Pre-crRNA通常由专用的核糖核酸酶Cas6加工，其裂解重复产生具有5'手柄，间隔区和3'茎环结构的CRISPR（cr）RNA。在I-C系统中，该功能由Cas5进行，Cas5是核糖核酸酶和效应复合物亚基。相同的crRNA可以由存在于相同细胞中的不同的I型或III型复合物共享。 Cas7蛋白作为“标尺”起作用，根据间隔区的长度结合间隔区以形成具有不同数量单体的链。在识别PAM和同源原型间隔区和R环形成时，专用干扰解旋酶 - 核酸酶Cas3被I型效应复合物募集。 HD域负责DNA切割。 III型系统缺乏Cas3，不识别PAM。在这些系统中，DNA切割需要效应复合物的大亚基Cas10的HD结构域和环化酶结构域的活性。 III型系统也可以通过Cas7家族蛋白靶向ssRNA，如亚型III-A中的Csm3和亚型III-B中的Cmr4。这些系统中的RNA和DNA降解反应是耦合的，确保靶向活性转录的噬菌体DNA。

效应复合物的结构组成：尽管序列相似性极低或无法检测，但I型和III型系统具有共同的效应复合组织原理。 I型和III型系统效应复合物的几种冷冻电子显微镜结构显示出整体结构和形状的显著相似性。 大多数亚基属于由三个不同组（Cas5，Cas6和Cas7）组成的RAMP（重复相关的神秘蛋白）家族。 通常，Cas6和Cas5蛋白含有两个RRM（RNA识别基序）结构域，而Cas7是单RRM蛋白。 效应复合物含有一个Cas5亚基和几个Cas7亚基。 Cas5亚基结合crRNA的5'端并与效应复合物的大亚基（I型的Cas8和III型的Cas10）相互作用，形成稳定的双亚基复合物。 小亚基通常以几个拷贝存在并与结合于Cas7的crRNA骨架相互作用。

辅助蛋白及功能：到目前为止，在类型1系统中常见的几组Cas蛋白质尚未与特定功能相关联。 具体而言，包含预测结合核苷酸配体且通常与DNA结合结构域和不同核酸酶结构域融合的含有CARF结构域的蛋白质涉及CRISPR-Cas功能的调节，包括感测遗传毒性应激和可能的偶联适应性免疫。

起源及进化：类型1的效应复合物以存在于Cas10中的RRM结构域和所有三个RAMP家族为中心。 还考虑到大亚基的C末端结构域（分别为I型和III型的Cas8和Cas10）与效应复合物的小亚基之间的同源性，这些复合物可能已经从含有RRM的单个Cas10样蛋白（具有核酸酶活性的结构域）进化而来。 Cas1和CRISPR重复可能起源于转座因子，称为Casposons，利用Cas1同系物作为整合酶。 大亚基的催化活性丧失和募集Cas3用于DNA切割是I型系统进化中的关键事件。 大亚基的进一步降解和适应模块（Cas1和Cas2）的丧失产生了IV型系统。

抗CRISPR蛋白和噬菌体编码的CRISPR-Cas系统：至少一些噬菌体编码多种抗CRISPR蛋白质。 尽管这些蛋白质仅在假单胞菌噬菌体中进行了实验研究，并显示出抑制I-F系统，但可以预测，其他病毒和整合元件编码许多目前没有明显特征的蛋白质，其对大多数CRISPR-Cas系统起作用。 相反，已经显示一些噬菌体编码靶向宿主防御基因的I型CRISPR-Cas系统

（2）类型2的CRISPR-Cas系统

第2类CRISPR-Cas系统的特征是由单个大的多结构域蛋白组成的效应子模块，这些蛋白似乎来源于可移动的遗传元件。 一些第2类效应蛋白，如Cas9和Cas12a（Cpf1）已成功用于基因组工程。现在经过iNature编辑组整理，奉献给您，希望对您有用。现在我们直接上图：

分类:CRISPR-Cas系统是在原核生物中发现的适应性免疫系统，并基于效应蛋白组织被分为两个不同类别。第1类CRISPR-Cas系统利用多蛋白效应复合物，而第2类CRISPR-Cas系统利用单蛋白效应物。基于不同的效应蛋白家族，第2类系统可分为三大类和九个亚型。第十亚型（V-U）包括许多假定的系统，其免疫（或可能是调节）功能仍有待证明。 2类系统占CRISPR-Cas基因座的约10％，在不同的细菌被发现，但在古细菌中几乎不存在。除了效应器蛋白质，大部分2类基因组编码适应性模块蛋白质，Cas1和Cas2以及辅助蛋白质，例如Cas4。 II型和V-B型基因座还包括tracrRNA（反式激活CRISPR RNA），其与重复部分互补并涉及CRISPR（cr）RNA加工和干扰。然而，某些2类系统，特别是类型6的系统仅由CRISPR阵列和效应蛋白组成。

CRISPR, RNA 成分 及 PAM：第2类系统的直接重复是回文或非回文。 II型和V-B型系统需要tracrRNA才能正常发挥功能，而V-A型系统则需要单独使用crRNA 。 crRNA和tracrRNA可以人工组合成一个单一的指导RNA（sgRNA），广泛用于Cas9介导的基因组编辑应用。

结构域组成：有三种类型的2类效应蛋白。 存在于II型和V型系统中的这些中的两种包含RuvC样核酸酶结构域（RNA酶H折叠），其典型地包含涉及crRNA和靶结合的大的结构域插入。 在所有II型系统（HNH家族核酸酶）和V-A型（NUC结构域，与HNH结构域无关，迄今为止在核酸酶中独一无二）中鉴定了第二个核酸酶结构域。 Cas9和Cas12a之间的另一个共同特征是参与tracrRNA结合的富含精氨酸的螺旋。

核酸酶结构：II型（Cas9）和V-A型（Cas12a）效应物的晶体结构揭示了共有的双叶形状但是不同的PAM相互作用区域和识别域。 VI型效应子与II型和V型效应子无关，含有HEPN超家族的两个核糖核酸酶结构域。 VI型效应物的结构仍有待解决。

作用机制：与其他CRISPR系统一样，间隔序列的获取需要Cas1和Cas2蛋白，虽然Cas9和tracrRNA的参与已经被证实为II型。干扰活性在II型和V型系统的情况下靶向dsDNA，但在VI型系统的情况下靶向ssRNA。在最好证实的II型系统中，tracrRNA被RNase III加工，之后，tracrRNA，Cas9和RNase III的复合物加工转录的CRISPR阵列（pre-crRNA）。由Cas9，tracrRNA和guide crRNA组成的II型效应复合物切割靶DNA，产生平端。 V-A型系统不需要tracrRNA，并且单独使用crRNA作为指导，向目标DNA中引入交错切割。除了靶DNA切割之外，类型V-A效应器Cas12a负责crRNA加工。类型VI-A效应器Cas13a（C2c2）是RNA引导的RNA酶。一旦RNA靶标识别被激活，Cas13a就成为非特异性的RNase，并且明显引起细胞毒性或死亡。类似于Cas12a，类型VI-A效应器Cas13a负责前crRNA加工和靶RNA切割。后者需要Cas13a的两个HEPN结构域，而不是前者的活性。

起源与进化：II型和V型系统的效应子与（主要）非自主转座子（分别称为IscB和TnpB）编码的RuvC样核酸酶同源。 已经发现了假定的进化中间体，其中TnpB编码基因与CRISPR阵列相关。 目前的进化模型假定进一步插入额外的结构域并与crRNA和可能的tracrRNA共同进化，导致出现II型和V型的大型多域效应蛋白.V型效应物可能已经从含有HEPN结构域的RNase，在某些1类CRISPR-Cas系统中作为辅助蛋白。

应用：随着Cas9介导的基因组编辑的大规模应用，CRISPR-Cas用于基因组调控，监测等功能随后被开发。 从概念上讲，有三个主要的应用领域：（1）基因组编辑，包括由II型或V型效应核酸酶产生的dsDNA断裂引发的基因敲除，敲入和突变; （2）使用相同核酸酶的催化失活的衍生物对DNA中的独特位点进行基因调控和递送各种功能部分（例如转录因子）; （3）使用VI型效应子（Cas13）靶向ssRNA以失活，编辑，修饰或定位。 与II型相比，V型效应器的独特特征（例如，自主crRNA加工，平头切割和正交PAM）在互补应用的开发中提供了多功能性，而VI型效应器可能在RNA靶向方面具有广泛的应用。

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