李红良涉嫌造假事件持续发酵，众多学者首次在Nature Medicine发文，质疑李红良4篇顶级文章
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在前期，主要是在一些媒体质疑李红良的文章有问题。就在这一次，肖卫东和肖啸等人在Nature Medicine杂志上正式发表题为“Impact of neutralizing antibodies against AAV is a key consideration in gene transfer to nonhuman primates”的论文，质疑李红良近期在Nature Medicine杂志上发表的4篇文章，提出了对于李红良4篇文章的忧虑，也希望李红良能给出正面给出回复；就在同一天，李红良也是在Nature Medicine进行了正面回复，题目是“Wang et al. reply”，该文详细介绍了以前的一些大家关心的忧虑。
致编辑：腺相关病毒（AAV）载体已广泛用作动物研究中基因递送的工具，以及基因治疗药物。最近，李红良及其同事在在Nature Medicine上连续发表了4篇关于非人灵长类动物模型（NHP）中，应用AAV血清型8载体（AAV8）研究非酒精性脂肪性肝炎的研究论文【1,2,3,4】。在每项研究中，通过AAV载体递送至肝脏的基因，证实了在这些大型动物模型中的转导，并且实现了治疗效果。
虽然AAV载体对于这些研究的目的来说是一个很好的选择，但从报道的方法报告中是否考虑了中和抗体（NAB）的问题还不清楚。在基因治疗领域中，NABs对抗AAV载体病毒衣壳形式的预先存在的免疫，是在NHPs和人类中成功基于AAV的基因转移的主要障碍【5】。通常情况下，由于预先存在NAB【6】，20-40％的患者被排除在具有特定AAV血清型的肝脏指导基因治疗中【6】。同样的问题适用于NHP研究，因为AAV8是NHP起源的AAV血清型，并且估计〜70-90％的猴子具有预先存在的针对AAV8的NAB【7,8】。在未发表的研究中，我们发现120只猴子中有4％对于AAV8 NAB是血清阴性的（数据未显示）。还应该注意的是，NAB发生的可能性实际上应该比老年动物更高，例如这些研究中使用的动物（年龄8-9岁）【1-4】。
然而，李红良团队的整体实验设计挑战了以前关于预先存在的NAB针对AAV病毒的发现的传统原理【1-4,9】。例如，在上述研究中，没有说明是否对任何猴子筛选了AAV8 NABs。此外，在对其CFLAR论文1.9的修正中，作者指出，在第7周将相同的AAV8载体注射到外周静脉中以“确保稳定表达”。然而，从第一次注射应该产生的针对AAV8的高滴度NABs已经阻止了第二次给药的任何成功的基因转导，特别是通过静脉内途径【10,11】。此外，我们应该注意到，即使在小动物中，即使NAB滴度的微小差异也会导致广泛的极大变异性。但是在这些研究中报道了高转导效率和低变异性，与许多其他的经验形成鲜明对比。
最后，我们还应该注意到，作者使用GFP来评估基因转移到肝脏的功效。它们显示几乎100％的肝细胞转导，并且表达维持30周。这一结果相当令人惊讶，考虑到即使所有猴子都预先用于NABs，由于AAV8强烈偏好NHPs中门静脉结构附近的肝细胞，所以本领域没有人能够实现统一的肝脏基因转移【12,13】。另外，在AAV给予NHP肝脏后，没有人能够实现GFP的长期表达【14】。虽然肝脏基因转移可促进对转基因产物的免疫耐受，但GFP在NHPs中具有高度免疫原性，导致有效的CD8 + T细胞应答消除转导的肝细胞。因此，目前还不清楚几乎所有肝细胞的长期GFP基因转移是如何完成的。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41591-018-0062-2
参考文章：
1.Wang, P. X. et al. Nat. Med. 23, 439–449 (2017).
2. Zhao, G. N. et al. Nat. Med. 23, 742–752 (2017).
3. Zhang, P. et al. Nat. Med. 24, 84–94 (2018).
4. Ji, Y. X. et al. Nat. Med. 24, 213–223 (2018).
5. Wang, L. et al. Hum. Gene Ter. 22, 1389–1401 (2011). 6. Mingozzi, F. & High, K. A. Annu. Rev. Virol. 4, 511–534 (2017).
7. Hurlbut, G. D. et al. Mol. Ter. 18, 1983–1994 (2010).
8. Gao, G. P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11854–11859 (2002).
9. Wang, P. X. et al. Nat. Med. 23, 1241 (2017).
10. Xiao, W. et al. J. Virol. 73, 3994–4003 (1999).
11. Bennett, J. et al. Sci. Transl. Med. 4, 120ra115 (2012).
12. Wang, L. et al. Mol. Ter. 23, 1877–1887 (2015).
13. Bell, P. et al. Mol. Genet. Metab. 104, 395–403 (2011).
14. Gao, G. et al. Hum. Gene Ter. 20, 930–942 (2009).
----李红良回应----
肖卫东教授和肖啸等人【1】在我们在自然医学最近发表的四篇论文中通过使用腺伴随病毒（AAV）血清型8载体，在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的非人灵长类动物（NHP）模型中对基因递送的效力表示担忧【2-5】。我们赞赏他们的担忧，但我们也注意到他们基于某些假设，而不是验证我们的实验结果。尤其是肖等人主要关心的是在我们的研究中是否考虑了抗AAV8的中和抗体（NABs）的存在。的确，他们是。
不仅在我们的研究中使用的每只猴子都测量了AAV8 NAB效价，而且我们还在每次猴子实验前筛选了各种感染性病毒和寄生虫作为标准实践。具体而言，只有那些结核菌素，B病毒，猿猴T细胞白血病病毒1型，SIV，猿逆转录病毒，体内寄生虫，体外寄生虫，沙门氏菌和志贺氏菌以及具有低或负NAB滴度阴性的猴子被用于所讨论的文献【2-5】。
购买了两批独立批次的猴子用于研究这四篇发表的论文。在第一批中，选择32只具有非常低或负NAB效价的猴子，并将它们用于CFLAR，TMBIM1和CYLD的平行研究中【2-4】。在第二批中，选择12只具有阴性或极低NAB滴度的猴子，并在TNFAIP3文件中进行基于AAV8的基因递送【5】。
使用先前建立的稍微修改的方法测量每只猴子的NAB滴度【6】。简而言之，将血清样品在56℃下热灭活30分钟，随后使用热灭活的FBS进行双重连续稀释。初始稀释度为1:10。然后将稀释的血清样品在巨细胞病毒启动子（AAV8-CMV-Luc; 1×108载体基因组（vg）每孔96孔板）的控制下与表达重组AAV8的萤光素酶在37℃孵育1小时。仅将病毒样品用作非NAB对照，并且将没有病毒的FBS用作非病毒对照。将混合物和对照加入到用Huh7细胞（每孔1x10 5个细胞）接种的96孔板中。温育24小时后，将细胞在PBS中洗涤两次并裂解。根据制造商的方案，用荧光素酶报道基因测定系统（编号E1910，Promega）显色裂解物，并在微孔板光度计（SpectraMax i3x，Molecular Devices）中测定发光。报道血清中的NAB滴度为50％萤光素酶表达被抑制时的稀释度。
对于我们的四篇论文中使用的猴子，NAB滴度范围从<1:10至1：10-1：20。已经清楚地报道了靶标基因可以在NAB效价<1:20的猴子中成功过表达（参考文献7,8,9）。重要的是，我们进一步通过以相对较高的剂量通过门静脉注射直接施用于肝脏来提供AAV8病毒在猴肝中的稳定和长期基因表达，遵循并结合上述在先前研究中应用的策略【9-12】。如通过western印迹分析所证实的，该方法允许所有处理的猴子的肝脏中高度的蛋白质表达。
鉴于提出的担忧，我们想指出，我们没有在我们的出版物中提出并讨论NAB效价测量的原因有两个。首先，正如肖卫东教授和肖啸等人在其通信中所述，在基因递送实验和临床试验中，有一种“常规原则”来筛选预先存在的NAB。我们同意，由于这方面的关注在该领域普遍受到重视，而且这种筛查是标准做法，所以我们不觉得必须报告这些数据。但其次，更重要的是，我们的科学观点是报告这些数据是否必要以及应包括多少细节取决于研究的科学重点和具体目的。我们认为，如果该研究项目旨在确定克服AAV介导的临床应用中基因转移障碍的新方法（如Xiao等人在其通信中所建议的），详细的NAB滴度筛选方法和结果至关重要。但是，建立一种新方法并不是我们研究的重点。相反，在我们的研究中，AAV仅被用作识别新型病理机制和测试疾病中潜在治疗靶点的工具（在我们的研究中为NASH）。当我们通过蛋白质印迹验证蛋白质表达来提供基因传递的证据时，我们认为对该方法的描述足以传达我们的方法。对于NABs在猴子身上可能存在的细节的缺乏以及NAB筛选过程的详细信息，我们深表歉意，这导致了我们论文的一些读者的困惑。但肖等人在其信函中的陈述是“整体实验设计挑战以前关于预先存在的NAB针对AAV病毒的发现的传统原理”仅仅是基于缺乏对我们研究的确切程序。
肖卫东教授和肖啸等人提出的另一个问题与我们的第二次AAV8管理有关。我们完全意识到一些研究者不支持在动物中重复施用AAV8载体，因为在初始注射后发展为NAB反应。不过，其他许多调查人员仍然乐观。 Bennett等【13】证明，将AAV重新注入对侧眼可增强最初注射AAV的眼睛的功能。重要的是，Petry等【14】的一项研究清楚地表明，使用与初始注射血清型相同血清型的AAV重新注射并不能减少通过肌内注射递送时第一次注射AAV载体时的转基因表达。此外，Nathwani等【8】的研究表明，外周静脉输注AAV8可以产生类似的表达效率，并且具有与猕猴门静脉输送相同的载体生物分布模式。鉴于目前了解第二次AAV注射可能有助于或至少不会减少第一次AAV给药后的基因表达，我们通过静脉注射（以避免由门静脉给药造成的第二次手术应激）进行第二次AAV8给药，其中稳定肝脏中基因表达的希望。我们承认我们不能排除第二次注射没有效果并且治疗效果完全归因于第一次注射的可能性。
关于广泛和长期的GFP表达问题，肖卫东教授和肖啸等人表示我们获得了“几乎100％的肝细胞转导，并且表达维持了30周”。然而，我们从未在我们任何发表的论文中提及关于GFP表达的任何一点。相反，我们明确指出，GFP检查是在最初的AAV门静脉注射后进行的。此外，转导的百分比不能从我们的论文中的免疫荧光图像确定。因此，我们不清楚肖等人是如何得出这些结论的。我们想在此强调，我们仅在AAV注射后早期进行GFP检查以确认基因递送的功效。相反，目标基因表达的最终成功使用实验终点处的靶蛋白的Western印迹分析来证实。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41591-018-0063-1
参考文章：
1.Xiao, W. et al. Nat. Med. 24, https://doi.org/10.1038/s41591-018- 0062-2 (2018).
2. Wang, P. X. et al. Nat. Med. 23, 439–449 (2017).
3. Zhao, G. N. et al. Nat. Med. 23, 742–752 (2017).
4. Ji, Y. X. et al. Nat. Med. 24, 213–223 (2018).
5. Zhang, P. et al. Nat. Med. 24, 84–94 (2018).
6. Haurigot, V. et al. J. Clin. Invest. 123, 3254–3271 (2013).
7. Gao, G. et al. Mol. Ter. 13, 77–87 (2006).
8. Nathwani, A. C. et al. Blood 109, 1414–1421 (2007).
9. Gao, G. P. et al. J. Virol. 80, 6192–6194 (2006).
10. Sharland, A., Logan, G. J., Bishop, A. & Alexander, I. E. Discov. Med. 9, 519–527 (2010).
11. Beattie, S. G. et al. Hum. Gene Ter. 19, 579–588 (2008).
12. Nathwani, A. C. et al. Mol. Ter. 19, 876–885 (2011).
13. Bennett, J. et al. Sci. Transl. Med. 4, 120ra115 (2012).
14. Petry, H. et al. Gene Ter. 15, 54–60 (2008).
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