Cell Res | 新突破，继 Cell之后，李晓江等团队首次在恒河猴产生帕金森病模型

iNature

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的神经系统变性疾病，老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金森病较少见。我国65岁以上人群PD的患病率大约是1.7%。大部分帕金森病患者为散发病例，仅有不到10%的患者有家族史。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺（dopamine, DA）能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。导致这一病理改变的确切病因目前仍不清楚，遗传因素、环境因素、年龄老化、氧化应激等均可能参与PD多巴胺能神经元的变性死亡过程。

在人类，PINK1突变导致常染色体隐性遗传和早发性帕金森病（PD）并伴有选择性神经变性。虽然已经在小鼠及猪产生了相关的疾病模型，但是这些模型并不能概括在PD患者中看到相关的神经变性，这意味着PINK1在哺乳动物大脑中的功能需要使用更接近人类的较大动物进行评估。

2019年2月16日，暨南大学/埃默里大学李晓江，埃默里大学李世华及北京协和医学院秦川共同通讯在Cell Research在线发表题为“CRISPR/Cas9-mediated PINK1 deletion leads to neurodegeneration in rhesus monkeys”的研究论文，该论文使用CRISPR / Cas9介导方法，产生了PINK1缺失导致了恒河猴的神经变性。PINK1突变猴中观察到的显著神经元丢失未在PINK1 KO小鼠或猪中报告，并且可能与PINK1的灵长类动物特异性表达和功能相关。PINK1突变猴的产生揭示了PINK1在灵长类大脑中的关键功能，并将提供一个新的研究PINK1的多种功能和与PINK1功能障碍相关的发病机制的工具。

另外，2018年12月4日，美国埃默里大学李晓江等在Cell Reports杂志发表题为“Shortening the Half-Life of Cas9 Maintains Its Gene Editing Ability and Reduces Neuronal Toxicity  ” 的研究论文，该研究表明Cas9的异位过表达确实可能引起神经毒性。并通过缩短Cas9蛋白的半衰期，在保留其基因编辑能力的同时，降低其神经毒性；2018年3月30日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院李晓江、中国科学院广州生物医药与健康研究院赖良学、美国Emory大学李世华共同通讯在Cell发表题为“A Huntingtin Knockin Pig Model Recapitulates Features of Selective Neurodegeneration in Huntington’s Disease”的 研究论文，该研究利用基因编辑技术（CRISPR/Cas9）和体细胞核移植技术，成功培育出世界首例亨廷顿舞蹈症基因敲入猪，能精准地模拟人类神经退行性疾病。这为开发治疗亨廷顿舞蹈症的新手段提供了稳定、可靠的动物模型，也为培育其它神经退行性疾病大动物模型提供了技术范本和理论依据（点击阅读）。

一直以来，拥有一种能够随意控制基因表达的技术成了很多生物学家的梦想。CRISPR/Cas9系统的出现满足了这种需要，Cas9就像是一把DNA剪刀，在sgRNA的带领下，特异性地切割目的序列，并形成DNA双链断裂。RNA引导的DNA结合和切割蛋白已被证明是用于基因组和表观基因组编辑的变革工具，可用于各种细胞类型和生物体的编辑。

恒河猴

PINK1突变导致常染色体隐性遗传和早发性帕金森病（PD）并伴有选择性神经变性。 不幸的是，目前的PINK1基因敲除（KO）小鼠和猪模型不能概括在PD患者中看到相关的神经变性。 此外，小鼠脑中的内源性Pink1以非常低的水平表达，并且只能通过免疫沉淀检测，这意味着PINK1在哺乳动物大脑中的功能需要使用更接近人类的较大动物进行评估。

研究人员在以前使用CRISPR / Cas9靶向单细胞期胚胎中的猴基因，这一次使用相同的方法，设计了两个gRNA来靶向恒河猴PINK1中的基因外显子2（T1）和外显子4（T2），这些区域都在激酶结构域。将CRISPR / Cas9和PINK1gRNA注射到单细胞阶段的恒河猴胚胎中。来自注射胚胎的PCR产物的T7E1测定和测序显示靶向PINK1的高效率（61.5％）。将87个胚胎转移到28个替代恒河猴，最后产生 11个胎儿发育成足月并自然出生。

文章总结

在这些存活的猴中，8个携带PINK1突变（M），3个是野生型（WT）。然而，三只突变猴（M1，M3和M4）是新生三胞胎，它们在出生后3-4天内难以存活并死亡。一只WT新生猴也死亡。另一只突变猴（M2）在出生后7天死亡，没有明显的症状。其他三只突变猴（M6，M7和M8）已经存活了三年;然而，M5减少了食物摄入并在1.5年时显示出虚弱状态，并且在麻醉后30天死于MRI检查。

对于存活时间较短的猴，研究人员发现在M1皮质和纹状体以及M2皮质中约65％-70％的PINK1等位基因携带~7.2kb缺失。 PINK1突变猴脑的蛋白质印迹分析也证实了PINK1，神经元蛋白（NeuN，PSD95，CRMP2和SNAP25）和双皮质素（DCX）的不同程度的缺陷。对于活猴，MRI和视频监测研究显示，具有PINK1突变的1.5岁成年猴显示皮质中的灰质密度显著降低。尽管睡眠行为没有改变，M5和M6猴子也表现出运动减少。 对M6猴脑基因组DNA的分析也显示PINK1外显子2和外显子4在各种组织中的大量缺失，并且蛋白质印迹分析显示皮质和黑质中PINK1表达与年龄相比显著降低。

PINK1突变猴中观察到的显著神经元丢失未在PINK1 KO小鼠或猪中报告，并且可能与PINK1的灵长类动物特异性表达和功能相关。然而，大多数PINK1突变患者并未表现出与PINK1突变猴相同的严重表型。 PINK1突变猴和患者之间神经变性和表型的差异很可能是由于不同类型的PINK1突变。越来越多的证据表明，PINK1的功能是多样的，并且其功能障碍不仅在PD中，而且在癌症和其他疾病中也有所作用。 PINK1突变猴的产生揭示了PINK1在灵长类大脑中的关键功能，并将提供一个新的研究PINK1的多种功能和与PINK1功能障碍相关的发病机制的工具。

参考信息：

https://www.nature.com/articles/s41422-019-0142-y#ref-CR6

https://baike.baidu.com/item/%E5%B8%95%E9%87%91%E6%A3%AE%E7%97%85/945855?fr=aladdin

—END—

内容为【iNature】公众号原创，欢迎转载

白名单回复后台「转载」

微信加群

iNature汇集了2万名生命科学的研究人员及医生。我们组建了40个综合群（8个PI群及32个博士群），同时更具专业专门组建了相关专业群（植物，免疫，细胞，微生物，基因编辑，神经，化学，物理，心血管，肿瘤等群）。温馨提示：进群请备注一下（格式如学校+专业+姓名，如果是PI/教授，请注明是PI/教授，否则就直接默认为在读博士，谢谢）。可以先加小编微信号（love_iNature），或者是长按二维码，添加小编，之后再进相关的群，非诚勿扰。

▼点击查看相关文章

iNature，专注前沿科学动态，传递科普信息。关注请长按上方二维码。投稿、合作、转载授权事宜请联系微信ID：18800248052 或邮箱：[e-mail]