Science/NBT | 领域的又一突破！刘如谦等首次实现高效、高纯度的 C•G 到 G•C 碱基编辑，有望治疗数百种遗传疾病

编者按

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可编程 C•G 到 G•C 碱基编辑器 (CGBE) 具有广泛的科学和治疗潜力，但其编辑结果已被证明难以预测，并且其编辑效率和产品纯度往往较低。2021年6月28日，博德研究所刘如谦，加州大学旧金山分校Britt Adamson及Jonathan S. Weissman在Nature Biotechnology 在线发表题为“Efficient C•G-to-G•C base editors developed using CRISPRi screens, target-library analysis, and machine learning”的研究论文，该研究描述了一套与机器学习模型配对的工程 CGBE，以实现高效、高纯度的 C•G 到 G•C 碱基编辑。该研究进行了针对 DNA 修复基因的 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 筛选，以确定影响 C•G 到 G•C 编辑结果的因素，并利用这些见解开发具有不同编辑配置特征的 CGBE。该研究在哺乳动物细胞中 10,638 个基因组整合目标位点的库中表征了 10 个有前途的 CGBE，并训练了机器学习模型，使用这些数据准确预测编辑结果的纯度和产量 (R = 0.90)。这些 CGBE 能够以 >90% 的精度（平均 96%）和高达 70% 的效率（平均 14%）校正 546 与疾病相关的颠换单核苷酸变体（SNV）的野生型编码序列。最佳 CGBE-单向导 RNA 对的计算预测能够在比使用任何单个 CGBE 变体多四倍的目标位点上进行高纯度颠换碱基编辑。总之，这项工作中提出的碱基编辑器和计算工具大大提高了 CGBE 介导的颠换碱基编辑的靶向范围、有效性和实用性。

另外，2021年6月2日，博德研究所David R. Liu（刘如谦）等团队在Nature 在线发表题为“Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice”的研究论文，该研究使用定制的腺嘌呤碱基编辑器 (ABE8e-NRCH) 将 SCD 等位基因 (HBBS) 转换为Makassar β-珠蛋白 (HBBG)，这是一种非致病性变异 。将编码碱基编辑器和靶向指导 RNA 的 mRNA 离体递送到 SCD 患者的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中，导致 80% 的 HBBS 转化为 HBBG。将编辑过的人类 HSPC 移植到免疫缺陷小鼠中 16 周后，HBBG 的频率为 68%，缺氧诱导的骨髓网织红细胞镰状细胞减少了 5 倍，表明基因编辑是持久的。为了评估 HBBS 碱基编辑的生理效应，该研究提供了 ABE8e-NRCH 并将 RNA 从人源化 SCD 小鼠导入 HSPC，然后将这些细胞移植到辐射小鼠中。十六周后，Makassar β-珠蛋白占血液中 79% 的 β-珠蛋白，缺氧引起的镰状细胞减少了三倍。与接受未编辑细胞的小鼠相比，接受碱基编辑的 HSPC 的小鼠显示出接近正常的血液学参数和减少的脾脏病理。编辑过的骨髓的二次移植证实了基因编辑在长期造血干细胞中是持久的，并表明 20% 或更多的 HBBS-to-HBBG 编辑足以进行表型拯救。人类 HSPC 的碱基编辑避免了在 Cas9 核酸酶处理后观察到的 p53 激活和更大的缺失。总之，这些发现表明 SCD 的一次性自体治疗可以消除致病性 HBBS，产生良性 HBBG，并最大限度地减少双链 DNA 断裂的不良后果（点击阅读）。

2021年2月19日，博德研究所刘如谦(David R.Liu)及哈佛医学院Dong Min共同通讯在Science 在线发表题为”Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity“的研究论文，该研究开发了具有同时阳性和阴性选择的噬菌体辅助蛋白酶进化系统，并将其应用于三种肉毒杆菌神经毒素（BoNT）轻链蛋白酶。该研究将BoNT / X蛋白酶进化为单独的变异体，这些变异体优先裂解囊泡相关膜蛋白4（VAMP4）和Ykt6，进化了BoNT / F蛋白酶以选择性裂解非天然底物VAMP7，并进化了BoNT / E蛋白酶以裂解磷酸酶和肌腱同源蛋白（PTEN），但不是神经元中的任何天然BoNT蛋白酶底物。进化的蛋白酶显示出特异性的大变化（218倍到 11,000,000倍），并且可以保留其形成自我递送至初级神经元的全毒素的能力。这些发现为重新编程蛋白酶建立了通用平台，以选择性地切割具有治疗意义的新靶标（点击阅读）。

单核苷酸变异约占目前已知的人类致病基因变异的一半。碱基编辑器是可编程 DNA 结合蛋白与碱基修饰酶的融合，能够转换基因组中的单个目标核苷酸 。碱基编辑器的两大类是胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)，将 C•G 转换为 T•A，以及腺嘌呤碱基编辑器 (ABE)，将 A•T 转换为 G•C。CBE 和 ABE 可以高效率和产品纯度（所有编辑的等位基因中仅包含所需编辑的部分）安装转换突变，但通常无法有效安装转换突变，包括 C•G 到 G•C。

之前已经证明 CBE 编辑副产物，包括 C•G 到 G•C 和 C•G 到 A•T 的颠换结果，受到细胞尿嘧啶 DNA N-糖基化酶 (UNG) 的敲除的抑制，表明颠换副产物是由 UNG 催化的脱氨基产生的无碱基中间体形成的。与该模型一致，第一代 CGBE 是缺乏 UGI 域的 CBE 衍生物。这些 CGBE，包括与 UNG 和其他 DNA 修复蛋白融合的编辑器 ，可以提供高效的 C•G 到 G•C 编辑，但仅在少数经过测试的目标位点上，并且几乎没有识别位点的标准适合 CGBE 编辑。 

以前，研究人员使用包含数千个基因组整合目标位点和哺乳动物细胞中相应引导 RNA 的文库来全面表征 CBE 和 ABE 碱基编辑配置。研究人员使用这些数据来训练机器学习模型（统称为 BE-Hive），该模型学习了驱动 CBE 和 ABE 剑姬编辑结果的序列决定因素。设想对 CGBE 编辑结果的序列决定因素进行广泛表征可以准确预测编辑效率和产品纯度，从而促进 CGBE 的更广泛使用。

在这里，该研究进行了集中 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 筛选，以识别影响胞嘧啶碱基编辑效率和纯度的 DNA 修复基因。在这些数据的指导下，该研究构建了各种包含脱氨酶和 Cas 蛋白的融合蛋白，这些蛋白与 DNA 修复成分融合，以设计具有有前景的 C•G 到 G•C 编辑活动的新 CGBE。

该研究使用由 10,638 个基因组整合、高度可变的小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中的靶位点组成的“综合上下文库”对十个具有不同编辑特征的 CGBE 进行了表征。该研究使用所得数据训练机器学习模型，成功预测 CGBE 编辑效率、纯度和旁观者编辑模式（CGBE-Hive），从而可靠识别 CGBE 变体和目标位点，共同支持高纯度 C•G- to-G•C 编辑。此外，该研究表明，与更简单的模型相比，深度学习模型可以以更高的准确预测编辑活动，这表明 CGBE-Hive 已经学习了复杂的序列特征，这些特征在确定 C-to-G 编辑活动中起着重要作用。值得注意的是，CGBE-Hive 预测将被 CGBE 编辑的 247 胞嘧啶具有 >80% C•G-to-G•C 编辑纯度确实在哺乳动物细胞实验中被编辑，平均纯度为 83%。

本研究中的 CGBE 提供了多种编辑配置特征，共同扩展了适合高质量 C•G 到 G•C 编辑的序列景观，比预测适合任何单一CGBE编辑的数量高出 4.1 倍。最后，该研究证明了 CGBE 介导的对 546 种疾病相关 SNV 的校正，在得到的编辑氨基酸序列中具有 >90% 的精度。这些发现促进了对颠换碱基编辑结果的理解，并提供了新的 CGBE，以提高碱基编辑的范围和效用。

总之，这项工作中提出的碱基编辑器和计算工具大大提高了 CGBE 介导的颠换碱基编辑的靶向范围、有效性和实用性。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-021-00938-z

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