Nat Biotechnol | 极大推动基因编辑技术走向临床！刘如谦团队通过改造pegRNA，显著提高了Prime编辑效率

编者按

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Prime 编辑（PE，先导编辑）可以在活细胞的 DNA 中安装几乎任何点突变、小插入或小删除的组合。Prime编辑指导 RNA (pegRNA) 将Prime编辑器蛋白引导至目标位点，并对目标位点进行编辑。PE 的多功能性源于 pegRNA 的 3' 延伸能够编码多种编辑序列。尽管具有多功能性，但当前prime编辑器的效率在目标位点和细胞类型之间差异很大。

2021年10月4日，博德研究所刘如谦（David R. Liu）团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency”的研究论文，该研究展示了包含逆转录酶模板和引物结合位点的 pegRNA 3' 区域的降解会毒害先导编辑系统的活性，从而阻碍编辑效率。

该研究将结构化的 RNA 基序合并到 pegRNA 的 3' 末端，以增强其稳定性并防止 3' 延伸的降解。由此产生的工程化 pegRNAs (epegRNAs) 在 HeLa、U2OS 和 K562 细胞以及原代人成纤维细胞中将主要编辑效率提高了 3-4 倍，而不会增加脱靶编辑活动。该研究优化了 3' 结构基序的选择并开发了 pegLIT，这是一种用于识别 pegRNA 和 3' 基序之间的非干扰核苷酸接头的计算工具。最后，该研究表明 epegRNA 提高了安装或纠正与疾病相关的突变的效率。

对生命系统的基因组进行有针对性的改变的能力继续推动着生命科学和医学的发展。双链断裂 (DSB) 介导的 DNA 编辑策略使用可编程核酸酶，如 ZFN、TALEN 或 CRISPR-Cas 核酸酶，可以通过在目标位点诱导插入或缺失（indel）来有效破坏基因，但 DSB 也会导致通常不受欢迎的结果，包括不受控制的编辑结果混合、较大的 DNA 重排 、p53 激活和 chromothrypsis。

尽管靶向 DSB 可以通过同源定向修复刺激精确的基因校正，但该过程在大多数治疗相关的细胞类型中效率低下。相比之下，碱基编辑器和prime编辑器 可以有效地在治疗相关细胞中安装精确的变化，而无需 DSB。胞嘧啶和腺苷碱基编辑器分别使 C•G 转化为 T•A 和 A•T 转化为 G•C，而 Prime 编辑器几乎可以安装任何局部突变，包括在目标 DNA 位点替换、插入和/或删除多达数十个碱基对。

Prime 编辑 (PE) 系统至少由两个组件组成：一种蛋白质，该蛋白质包含与工程逆转录酶 (RT) 融合的可编程 DNA 切口酶和 pegRNA。pegRNA 包含一个指定目标位点的间隔区、一个单向导 RNA (sgRNA) 支架和一个编码所需编辑的 3' 延伸。此扩展包含一个引物结合位点 (PBS)，该位点与 DNA 原型间隔区的一部分和编码所需编辑和下游基因组序列的 RT 模板互补。在 PE 核糖核蛋白 (RNP) 与靶位点结合并切割含 PAM 的 DNA 链后，由此产生的带切口的 DNA 链碱基配对到 pegRNA 中的 PBS，启动 RT 模板的逆转录直接进入目标 DNA 位点。然后通过细胞 DNA 修复途径，导致在目标位点安装所需的编辑。

PE 的多功能性源于 pegRNA 的 3' 延伸能够编码多种编辑序列。尽管具有多功能性，但当前prime编辑器的效率在目标位点和细胞类型之间差异很大。在这里，该研究报告了 pegRNA 3' 延伸的假定降解会降低 PE 效率。尽管由此产生的截短的 pegRNA 会竞争目标位点的参与，但它们对 PE 无能为力。为了解决此漏洞，该研究确定了保护 pegRNA 完整性并通过多种递送方式在多种细胞系中的各种靶位点广泛提高 PE 效率的 RNA 基序。由此产生的 epegRNA 大大提高了 PE 的有效性和应用范围。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41587-021-01039-7

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