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线粒体 DNA (mtDNA) 被细胞器膜包裹，形成了基于 CRISPR 的基因编辑工具访问 mtDNA 的屏障。最近的研究将 DdCBE 定位为一种有前途的技术，可以在哺乳动物 mtDNA 中安装靶向突变或引入碱基转换的可遗传突变。DdCBE 的脱靶特征仍有待通过进一步的研究来全面研究，以了解它们对 mtDNA 和核基因组的系统影响。2022年3月18日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙、上海交通大学章美玲共同通讯在 Cell Discovery （IF=11）在线发表题为“Mitochondrial base editor DdCBE cause substantial DNA off-target editing in nuclear genome of embryos” 的研究论文，该研究使用 GOTI方法（点击阅读），以评估 DdCBE 对 mtDNA 和核 DNA 修饰的脱靶效应。该研究首次展示了 DdCBE 在整个核基因组中导致数千个脱靶 SNV，这些 SNV 富含 C-to-T/G-to-A 转换，这是低保真碱基编辑器 BE3 产生的 SNV 数的两倍。总之，该研究发现DdCBE 对核基因组具有广泛的脱靶效应，强烈需要优化 DdCBE 以在 mtDNA 上进行特定的碱基编辑，特别是在用于治疗线粒体疾病之前。另外，2022年2月1日，上海交通大学章美玲，李文及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉共同通讯在 Cell Discovery 在线发表题为“Human cleaving embryos enable efficient mitochondrial base-editing with DdCBE” 的研究论文，该研究表明，DdCBE 是一种有效的碱基编辑器，可在人类胚胎 mtDNA 中诱导点突变，并且在 8 细胞胚胎中的效率要高得多。 鉴于旁观者和脱靶编辑特征，DdCBE 仍有待进一步优化用于未来的基础和治疗研究。2022年2月1日，南京医科大学许争锋、沈斌及凌秀凤共同通讯在 Cell Discovery 在线发表题为“DdCBE-mediated mitochondrial base editing in human 3PN embryos” 的研究论文，该研究首次证明了在人类 3PN 胚胎中进行 DdCBE 介导的线粒体碱基编辑的可行性，表明在人类早期胚胎阶段进行致病性 mtDNA 突变校正的可能性。 理论上，DdCBE可以纠正mtDNA中的一系列致病性A ∙ T-to-G ∙ C突变，从而达到治疗效果。尽管在 3PN mtDNA 中检测到的脱靶编辑可能不足以产生表型，但当前的线粒体碱基编辑策略需要进一步优化以满足任何临床应用的需求。2020年7月8日，博德研究所David R. Liu及华盛顿大学医学院Joseph D. Mougous共同通讯在Nature 在线发表题为“A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing”的研究论文，该研究描述了一种细菌间毒素，将其命名为DddA，它可以催化dsDNA中胞苷的脱氨。该研究设计了无毒且无活性的split-DddA半分子：DddA分割的一部分结构域（转录激活子样效应子阵列蛋白）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂的融合，产生了无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人mtDNA中的C•G到T•A转化，具有高靶标特异性和产品纯度。该研究使用DdCBEs建模人类细胞中与疾病相关的mtDNA突变，从而导致呼吸速率和氧化磷酸化的改变。不含CRISPR的DdCBE可以精确操纵mtDNA，而不是消除因被靶向核酸酶切割而产生的mtDNA拷贝，这对线粒体疾病的研究和潜在治疗具有广泛的意义（点击阅读）。
线粒体 DNA (mtDNA) 被细胞器膜包裹，形成了基于 CRISPR 的基因编辑工具访问 mtDNA 的屏障。此外，在 ZFN、TALEN 等可编程核酸酶诱导双链断裂后，线粒体基因组缺乏类似的修复系统来保护核基因组免受 DNA 损伤，这导致靶标 mtDNA 的消除而不是 mtDNA 上的突变安装，与核 DNA 上插入缺失形成的结果形成对比。最近的研究将 DdCBE 定位为一种有前途的技术，可以在哺乳动物 mtDNA 中安装靶向突变或引入碱基转换的可遗传突变，而不是用以前的基于 ZF 或 TALE 的核酸酶消除它们。因此，DdCBE 有可能模拟线粒体疾病突变、纠正致病变异并扩展对线粒体生物学的了解。然而，值得一提的是，这些研究发现，DdCBE 可以在 mtDNA 上引起低频率的脱靶事件。如前所述，DdCBE 的脱靶特征仍有待通过进一步的研究来全面研究，以了解它们对 mtDNA 和核基因组的系统影响。
使用 GOTI 对 DdCBE 进行线粒体和核基因组编辑的脱靶分析（图源自Cell Discovery ）
该研究使用之前开发的 GOTI方法，以评估 DdCBE 对 mtDNA 和核 DNA 修饰的脱靶效应。该研究首次展示了 DdCBE 在整个核基因组中导致数千个脱靶 SNV，这些 SNV 富含 C-to-T/G-to-A 转换，这是低保真碱基编辑器 BE3 产生的 SNV 数的两倍。与 BE3 蛋白中的胞嘧啶脱氨酶 APOBEC1 对 ssDNA 的底物偏好不同，DdCBE 蛋白中的 DddAtox 是一种以 dsDNA 为底物的独特类型的胞嘧啶脱氨酶。它可能解释了 DdCBE 比 BE3 观察到的更多脱靶 SNV。总之，该研究的DdCBE 对核基因组的脱靶活性的发现，强烈需要优化 DdCBE 以在 mtDNA 上进行特定的碱基编辑，特别是在用于治疗线粒体疾病之前。https://www.nature.com/articles/s41421-022-00391-5https://www.nature.com/articles/s41421-021-00358-yhttps://www.nature.com/articles/s41421-021-00372-0https://www.nature.com/articles/s41586-020-2477-4
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