合作26项成果！浙江大学范衡宇/广东省第二人民医院沙倩倩等团队在生殖表观遗传领域取得重要进展

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广东省第二人民医院沙倩倩与浙江大学范衡宇合作了26项研究成果，由于篇幅限制，iNature在这介绍其中的10项成果：【1】2022年10月28日，浙江大学范衡宇及广东省第二人民医院沙倩倩共同通讯在Science Advances 在线发表题为“PABPN1 functions as a hub in the assembly of nuclear poly(A) domains that are essential for mouse oocyte development  ”的研究论文，该研究表明由PABPN1-mRNA的相分离特性形成的NPAD是新转录mRNA的枢纽，对卵母细胞的发育和雌性生殖至关重要。【2】2022年6月9日，广东省第二人民医院沙倩倩及浙江大学范衡宇共同通讯在Nature Communications 在线发表题为“Dynamic mRNA degradome analyses indicate a role of histone H3K4 trimethylation in association with meiosis-coupled mRNA decay in oocyte aging”的研究论文，该研究发现在高龄女性完全发育的卵母细胞中，编码调节母体 mRNA 降解组的关键因子的转录物的储存减少。在衰老的小鼠卵母细胞中也检测到减数分裂成熟触发的 mRNA 清除的类似缺陷。从机制上讲，卵母细胞成熟的表观遗传和细胞质方面在正常发育和衰老过程中是同步的。组蛋白H3K4me3 水平在成熟小鼠和和来自年轻女性的人类卵母细胞中较高，但在衰老过程中由于导致 H3K4me3 积累的表观遗传因子表达减少而降低。卵母细胞特异性敲除编码 CxxC finger蛋白 1 (CXXC1) 的基因（一种 SETD1 甲基转移酶的 DNA 结合亚基）会导致与加速衰老和母体 mRNA 翻译和降解受损相关的卵质变化。这些结果表明，CXXC1 维持的 H3K4me3 网络与 mRNA 衰变能力相关，为卵母细胞退化设定了一个计时器，并在小鼠和人类卵母细胞的卵母细胞衰老中发挥作用。【3】2022年5月30日，广东省第二人民医院沙倩倩，浙江大学范衡宇及沈立共同通讯在Nucleic Acids Research（IF=19）在线发表题为“USP16-mediated histone H2A lysine-119 deubiquitination during oocyte maturation is a prerequisite for zygotic genome activation  ”的研究论文，该研究使用染色体免疫沉淀和测序研究了小鼠 MZT 期间 H2AK119ub1 的全基因组动态分布。结果表明，H2AK119ub1 在完全成熟的卵母细胞中积累，并在母体基因的 TSS 中富集，但在包括早期合子基因的 TSS 在内的全基因组减数分裂恢复后，通过以前未知的机制迅速下降。遗传证据表明，泛素特异性肽酶 16 (USP16) 是小鼠卵母细胞中 H2AK119ub1 的主要去泛素酶。条件性敲除卵母细胞中的 Usp16 不会影响它们的存活、生长或减数分裂成熟。然而，缺乏 USP16 的卵母细胞在经历合子基因组激活或受精后获得发育能力时存在缺陷，这可能与合子基因组上高水平的母体 H2AK119ub1 沉积有关。总之，H2AK119ub1 水平在卵母细胞成熟期间通过 USP16 依赖性机制下降，这确保了合子基因组重编程和必需的早期合子基因的转录激活。【4】2021年3月16日，广东省第二人民医院沙倩倩及浙江大学范衡宇共同通讯在Advanced Science 在线发表题为“The CNOT4 Subunit of the CCR4-NOT Complex is Involved in mRNA Degradation, Efficient DNA Damage Repair, and XY Chromosome Crossover during Male Germ Cell Meiosis  ”的研究论文，该研究构建了可存活的Cnot6/6l双敲除小鼠，雄性可育。这些结果表明CNOT7在体内具有不依赖CNOT6/6L的功能。还证明 CNOT4 是精子发生过程中植入后胚胎发育和减数分裂进程所必需的。在雄性生殖细胞中条件性敲除 Cnot4 会导致 DNA 损伤修复缺陷和 X 和 Y 染色体之间的同源交叉。CNOT4 通过将 mRNA 靶向 CNOT7 以使 poly(A) 尾部去腺苷酸化，从而作为以前未被识别的 CCR4-NOT 的 mRNA 接头发挥作用，从而介导转录物子集从合子到粗线期的降解。在合子向粗线期转变期间由 CNOT4 调节的 CCR4-NOT 复合物促进的 mRNA 去除对于参与随后的精子发生事件的基因的适当表达，减数分裂过程中正常的 DNA 双链断裂修复，X 和 Y 染色体之间的有效交叉，以及最终的男性生育能力至关重要。【5】2021年2月23日，广东省第二人民医院沙倩倩，浙江大学范衡宇及沈立共同通讯在Nucleic Acids Research（IF=19）在线发表题为“Role of CxxC-finger protein 1 in establishing mouse oocyte epigenetic landscapes   ”的研究论文，该研究调查了敲除 Cxxc1 的卵母细胞中基因组 H3K4me3 景观的变化以及对其他表观遗传因素（如 DNA 甲基化、H3K27me3、H2AK119ub1 和 H3K36me3）的影响。敲除 Cxxc1 后，H3K4me3 整体下降，包括启动子区域和基因体。CXXC1 和 MLL2 是另一种组蛋白 H3 甲基转移酶，在卵子发生过程中介导 H3K4 三甲基化方面具有不重叠的作用。Cxxc1 缺失导致 DNA 甲基化水平降低并影响 H3K27me3 和 H2AK119ub1 分布，特别是在 DNA 甲基化水平高的区域。与 Cxxc1 缺失有关的表观遗传网络的变化与相应基因组区域中基因的转录变化相关。本研究阐明了 Cxxc1 缺失的卵母细胞表型和分子缺陷的表观遗传变化，并强调了 CXXC1 在协调多种因素中的作用，这些因素涉及建立母体基因组的适当表观遗传状态。【6】2020年10月1日，浙江大学范衡宇，中南大学林戈及广东省第二人民医院欧湘红共同通讯（广东省第二人民医院沙倩倩为第一作者）在Nature Communication在线发表题为“Dynamics and clinical relevance of maternal mRNA clearance during the oocyte-to-embryo transition in humans”的研究论文，该研究报告了人类 MZT 期间合子基因组激活 (ZGA) 依赖性和非依赖性母体 mRNA 清除过程，并证明人类母体转录物的亚组在母体 (M) 和合子 (Z) 衰减途径之前和之后依次去除ZGA。考虑到母体 mRNA 衰变缺陷与体外受精人类胚胎早期发育停滞之间的相关性，M-decay 和 Z-decay 途径活动可能有助于人类植入前胚胎的发育潜力。【7】2019年11月28日，浙江大学范衡宇，沈立及广东省第二人民医院欧湘红共同通讯（浙江大学沙倩倩为第一作者）在Nucleic Acids Research 在线发表题为“Characterization of zygotic genome activation-dependent maternal mRNA clearance in mouse   ”的研究论文，该研究确定了在 ZGA 后降解的小鼠母体转录物，并表明抑制从头转录可以稳定小鼠胚胎中的这些 mRNA。该研究表明 YAP1-TEAD4 转录因子介导的转录对于小鼠胚胎中的 Z 衰变至关重要，并且 TEAD4 触发末端尿苷酰转移酶 TUT4 和 TUT7 的合子表达以及 mRNA 3'-寡尿苷化直接 Z 衰变。M-decay 通路的成分，包括 BTG4 和 CCR4-NOT 去腺苷酶，在 Z-decay 中继续发挥作用，但需要合子因子的强化才能及时去除母体 mRNA。在卵母细胞减数分裂成熟期间，长的 3'-UTR 和主动翻译赋予 Z 衰变转录物对 M 衰变的抗性。 Z-衰变途径是小鼠胚胎发育超过四细胞阶段所必需的，并有助于植入前胚胎的发育能力。【8】2018年8月28日，浙江大学范衡宇团队（浙江大学沙倩倩为第一作者）在Nature Communication 在线发表题为“CFP1 coordinates histone H3 lysine-4 trimethylation and meiotic cell cycle progression in mouse oocytes   ”的研究论文，该研究报告卵母细胞特异性敲除 Cxxc1、抑制 CFP1 功能或消除卵母细胞中的 H3K4 甲基化都会导致减数分裂恢复延迟以及由于纺锤体组装缺陷和染色体错位导致的中期 I 停滞。这些现象部分归因于组蛋白 H3 在 threonine-3 处的磷酸化不足。CDK1 触发 CFP1 的细胞分裂耦合降解和抑制性磷酸化。防止 CFP1 降解和磷酸化会导致 CFP1 在染色体上积累并损害减数分裂成熟和植入前胚胎发育。因此，CFP1 介导的 H3K4 三甲基化为 G2-M 转换提供了 3a 许可信号。CFP1 的双重抑制从染色质中去除了 SETD1-CFP1 复合物，并确保在减数分裂和有丝分裂期间适当的染色体构型变化。【9】2015年8月18日，浙江大学范衡宇团队（浙江大学沙倩倩为共同第一作者）在Nature Communication 在线发表题为“CRL4–DCAF1 ubiquitin E3 ligase directs protein phosphatase 2A degradation to control oocyte meiotic maturation”的研究论文，该研究显示 CRL4 通过蛋白磷酸酶 2A 支架亚基 PP2A-A 的蛋白酶体降解来控制卵母细胞减数分裂成熟。DDB1 或 DCAF1（也称为 VPRBP）的卵母细胞特异性缺失导致减数分裂恢复延迟和未能完成减数分裂 I 以及 PP2A-A 积累。DCAF1 直接结合并导致 PP2A-A 的多泛素化。此外，Ppp2r1a 的联合缺失挽救了由 DDB1/DCAF1 缺陷引起的减数分裂缺陷。这些结果提供了体内证据，表明 CRL4 定向的 PP2A-A 降解对于调节卵母细胞减数分裂和女性生育能力在生理上是必需的。【10】2022年7月8日，浙江大学范衡宇，广东省第二人民医院沙倩倩及北京大学乔杰共同通讯在Nucleic Acids Research（IF=19）在线发表题为“NAT10-mediated N4-acetylcytidine modification is required for meiosis entry and progression in male germ cells  ”的研究论文，该研究证明了唯一已知的 ac⁴C 催化酶 N-乙酰转移酶 10 (NAT10) 在男性生殖中起着至关重要的作用。该研究确定了小鼠组织 mRNA 中 ac⁴C 的发生，并表明 ac⁴C 在精子发生过程中发生动态变化。Nat10 的生殖细胞特异性缺失严重抑制减数分裂进入并导致同源染色体联会、减数分裂重组和减数分裂期间 DNA 双链断裂修复的缺陷。转录组分析揭示了 Nat10 缺失后减数分裂前期 I 功能基因的失调。这些发现突出了 ac⁴C 修饰在男性精子发生中的关键生理功能，并扩大了我们对其在体内特定生理过程调节中作用的理解。

方法的创新推动了发现和表征 RNA 修饰的快速进展。迄今为止，已经报道了超过 170 种RNA化学修饰，统称为表观转录组。表观转录组在 mRNA 生命周期的几乎每个方面调节各种生物过程，包括剪接、核输出、稳定性维持和周转。已经大量努力证明这些修饰与发育缺陷和疾病广泛相关，包括癌症、线粒体疾病、神经系统疾病和糖尿病。

哺乳动物 mRNA 最丰富和广泛探索的修饰是 N⁶-甲基腺苷 (m⁶A)。这种修饰调节与生殖和发育障碍、病毒感染、炎症和各种癌症相关的广泛生理功能。然而，其他修饰（例如 mRNA 中的 N4-乙酰胞苷（ac⁴C））的潜在调节机制和生理后果仍然知之甚少，尤其是在哺乳动物中。

N4-乙酰胞苷是真核和原核细胞中高度保守的 RNA 修饰，首先在酵母 [tRNA^Leu, tRNA^Ser] 和大肠杆菌中发现。随后, 在人类和酵母的 18S rRNA 上检测到 ac⁴C，并被发现在维持蛋白质翻译的准确性方面发挥作用。最近，ac⁴C 已被表征为人类 mRNA 的广泛标记；它提高了转录稳定性和翻译效率。相比之下，后来的一项研究报告了一个不同的结论，即在人类和酵母 mRNAs 中不能直接检测到 ac⁴C 位点，但它们可以通过乙酰转移酶复合物的大量过表达来诱导。

tRNA、rRNA 和 mRNA 中所有记录的 ac⁴C 事件均由唯一已知的催化酶 N-乙酰转移酶 10 (NAT10)（在人类中）或其同源物 Kre33（在酵母中）催化。而且，人体体液中ac⁴C的丰度在各种疾病条件下都有显著变化，提示人类疾病的发生与ac⁴C高度相关。然而，ac⁴C 在疾病中的潜在致病作用及其在体内的生理功能仍不清楚，需要进一步研究。

NAT10 在多种组织和雄性生殖细胞中的表达（图源自Nucleic Acids Research ）

目前全世界约有三分之一的夫妇正在与不孕症问题作斗争；50% 的此类病例归因于男性不育症。然而，男性不育的致病机制尚未完全阐明。减数分裂是有性生殖的基础，需要通过同源配对、联会、重组和染色体分离产生单倍体配子来确保基因组稳定性和可遗传多样性。同源重组是减数分裂的标志，是通过适应进化的关键驱动力。

减数分裂重组始于 Spo11 在“热点”区域形成数百个程序化 DNA 双链断裂 (DSB)。随后，切除的断裂 DNA 末端加载有单链 DNA 结合蛋白（RPA、DMC1 和 RAD51）以促进同源识别和链入侵，从而通过联会复合体 (SC) 的组装促进联会起始。尽管数十年的研究专注于同源联会和重组，但这些事件的协调机制仍然知之甚少。RNA 修饰是否可以在转录或转录后水平塑造这些标志性事件仍有待确定。

在这里，该研究证明了NAT10 的表达具有组织和细胞特异性——它在生殖器官中高度表达。该研究确定了 mRNAs 中 ac⁴C 的发生，并表明它在不同器官中以不同水平存在，并在精子发生过程中发生动态变化。此外，该研究揭示了 Nat10 的生殖细胞特异性失活导致减数分裂进入抑制和同源染色体联会缺陷、减数分裂重组和 DNA DSB 在减数分裂前期 I 的修复。总之，这些发现突出了ac⁴C 修饰在男性精子发生中的关键生理功能，并扩大了我们对其在体内特定生理过程调节中作用的理解。

参考消息：

https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac594/6633898?login=false

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=%28SHA+QIAN-QIAN%29+AND+%28FAN+HENG-YU%29&sort=date

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