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「伤口愈合时为什么痒?」Cell子刊教你做细胞交互研究!

Summer 科研讲坛 2021-02-21
大家一定有过这样的感受,在伤口愈合结痂时会感觉到发痒,有的人认为是因为在“长肉”,有的人认为是因为新生的神经相较为敏感,这些想法似乎都有一定的道理,但背后的生物学机制似乎还不太清楚。


最近,Cell子刊Immunity发表了NIH陈万军团队题为The Cytokine TGF-β Induces Interleukin-31 Expression from Dermal Dendritic Cells to Activate Sensory Neurons and Stimulate Wound Itching的研究,他们发现伤口愈合时的瘙痒竟然是由于真皮2型树突状细胞(cDC2s)分泌白介素-31(IL-31),进而作用于神经细胞引起瘙痒。

 
这篇文章不仅从生物学机制的角度满足了大家的好奇心,它的免疫细胞-神经细胞的细胞交互作用研究的思路也是很值得大家学习的,明年申请国自然时套上这一思路,档次是不是瞬间就上来了!

1. 研究思路

1)差异分析找到核心分子——IL-31

  • 找到关键分子
首先,作者通过监测病人(病人自我评估)和小鼠模型(搔抓反应)中急性伤口愈合引起的瘙痒情况,来确定皮肤伤口愈合期间瘙痒反应的进展,结果发现在伤口愈合第5天瘙痒达到了高峰。为了研究在伤口愈合过程中是否存在导致瘙痒的可溶性因子,作者在伤口愈合前和愈合过程中多次收集组织并进行RNA-seq实验,最终锁定IL-31作为皮肤切口后诱发瘙痒的候选因子。进一步的qPCR和ELISA结果也证实IL-31在整个创面愈合过程中表达增加,并在切口后第5天达到高峰。

 
  • 关键分子表型验证
在筛选得到关键分子IL-31后,需要进一步验证IL-31可以引起我们研究的表型。如果IL-31与伤口愈合过程中的瘙痒反应有关,那么给予额外的IL-31应该会进一步增强这些反应,而去除IL-31将会削弱这些反应。
作者进一步的实验发现,额外注射IL-31的小鼠比未注射IL-31的小鼠表现出更多的抓挠,而敲除IL-31的小鼠的抓挠则显著低于野生型小鼠。这些结果表明IL-31确实是导致伤口愈合过程中瘙痒反应的关键分子。

 

2)下游细胞研究——IL-31到哪里去?(IL-31如何作用于神经细胞引起瘙痒)

锁定关键分子并确认于表型的关系后,接下来就要做IL-31引起瘙痒的分子机制了。既然是做瘙痒,首先想到的就是IL-31是否会直接作用于神经细胞呢?结合前期的文献报道,作者使用RT-PCR比较了在切口后5天和基线期间,支配伤口部位的背根神经节(DRGs)中与信号转导相关分子的基因表达情况,结果发现感觉神经元在愈合过程中Il31ra、Trpv1和Nppb的表达上调,进一步的实验发现IL-31单独处理足以诱导Trpv1、Il31ra和nppb表达的上调。此外,IL-31处理24小时可增强辣椒素刺激的DRGs神经元的钙内流。这些结果提示IL-31可能增加感觉神经元中关键信号转导分子的表达,并使这些神经敏感。

 
那么,IL-31又是通过什么机制增加这些分子的表达的呢?
前期文章表明IL-31通过作用于IL-31ra受体,进而通过Jak1介导的通路诱导基因表达和神经活动的改变。所以作者进一步探索了DRG神经元中IL-31对Stat蛋白的调控作用,结果表明IL-31可以诱导Stat3的磷酸化,而Stat3抑制剂S31-201可以阻断IL-31诱导的表型,提示IL-31通过激活Stat3蛋白发挥作用。

 

3)上游细胞研究——IL-31从哪儿来?(IL-31由什么细胞分泌,为何分泌)

  • 锁定树突状细胞
研究完IL-31是如何影响下游神经细胞引起瘙痒的机制,还剩最后一个问题没有解决——伤口愈合过程中IL-31从何而来?
首先作者发现T细胞和B细胞不是IL-31的主要来源,随后作者进一步分析伤口皮肤中的CD3-非T细胞时,结果发现树突状细胞(DCs)与巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞相比,Il31表达水平更高。如果DCs是伤口中IL-31的主要来源,则在伤口愈合过程中减少皮肤中的DCs应可缓解瘙痒。作者构建了一种cDCs的耗竭小鼠模型,结果发现这些小鼠在伤口愈合过程中没有表现出更多的瘙痒行为,提示DCs是IL-31的主要来源。

 
  • 锁定树突状细胞的亚型
本来工作做到这里已经很复杂了,作者还要进一步确定是哪个DCs亚型表达IL-31。作者对郎格汉斯细胞(LCs)、1型cDCs(cDC1s)、cDC2s和巨噬细胞进行了分选,发现其中cDC2s的Il31表达水平最高。作者分别构建了剔除DCs、LCs、巨噬细胞的小鼠模型,发现只有剔除了DCs的小鼠在伤口愈合时搔抓行为减少。此外,作者从第5天的伤口或正常皮肤中纯化cDC2s,并将其注射到未受伤的受体小鼠体内,结果发现伤口部位来源的cDC2s增加了小鼠的搔抓行为,而来源于正常皮肤或Il31敲除小鼠伤口部位的cDC2s却不会带来这一变化。这些结果证明真皮层的DCs是产生IL-31的主要来源。

 
  • 找到诱导真皮cDC2s发生改变的因素
因为健康皮肤中的cDC2s的IL-31表达水平较低,所以作者还进一步探究了伤口中导致cDC2s中IL-31表达升高的原因。据报道,细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17a、TGF-β1和TNF-α是在调节创伤修复中发挥重要作用,作者检测了这些细胞因子对真皮cDC2s中IL-31表达的诱导作用。结果发现TGF-β1可通过其经典通路显著诱导皮肤cDC2s中的Il31表达。

 

2. 全文总结

这篇文章证实了伤口愈合过程中产生的细胞因子TGF-β1可诱导真皮树突状细胞IL-31的表达,IL-31可激活感觉神经元,进而诱发创面瘙痒。通过识别这一神经免疫通路并确定该过程涉及的关键机制,该研究确定了在伤口愈合期间发生瘙痒的潜在治疗靶标。

 
这篇文章机制上为细胞交互研究,全文思路清晰,论证完整,值得我们模仿学习。细胞交互机制是机制研究中最复杂的一类,学会这一研究模式,会为我们的课题设计增添不少光彩,希望能对大家有所启发,来年申请国自然时不妨试一试这一思路!


3. 参考文献
https://www.cell.com/immunity/fulltext/S1074-7613(20)30278-8


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