一篇10分文章告诉你免疫相关研究可以做哪些实验

人体免疫系统是保护机体不受外界疾病侵袭的关键保障，然而过度的免疫容易伤及自身，因此免疫系统具有自稳机制。免疫细胞通过表达免疫检查点分子抑制自身过度激活，此外肿瘤细胞会利用免疫检查点分子使机体无法产生有效的抗肿瘤免疫应答，形成肿瘤免疫逃逸。针对相应的免疫检查点研发的一些单抗类药物，能够阻断表达免疫检查点分子的免疫细胞与肿瘤细胞之间的作用，从而阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用，这一作用机制称为免疫治疗。近几年，肿瘤免疫治疗彻底改变了癌症治疗。肿瘤免疫治疗是通过刺激患者自身的免疫系统，让肿瘤发病过程中出现缺陷的免疫系统“恢复正常”，其控制肿瘤的效果通常比传统的化疗更持久、毒性更小。

免疫治疗的具体作用机制是如何的，研究这一机制需要应用到哪些实验技术，今天小编给大家分享的一篇文章就是研究针对免疫检查点PD-1的免疫治疗药物PD-1抗体在胶质瘤中的全新作用机制。该文今年6月份发表在Clin Cancer Res（IF：10.107）上，名为“Anti-PD-1 induces M1 polarization in the glioma microenvironment and exerts therapeutic efficacy in the absence of CD8 cytotoxic T cells”。研究发现pd-1抗体在没有CD8 T细胞的情况下，通过ADCC机制消除胶质瘤微环境中表达PD-1的巨噬细胞，并诱导小部分巨噬细胞M1极化，从而发挥治疗作用。

1. 技术路线图

从技术路线图可以看出文章研究内容主要分为两大部分：一是分析去除CD8 T细胞后，胶质瘤微环境中发生显著变化的免疫细胞群；二是从免疫细胞层面出发，分析PD-1抗体处理抑制肿瘤进展的具体机制。

2. 研究结果

2.1 CD8 T细胞缺失时，先天免疫增强

1）研究人员首先敲除CD8基因，构建CD8 T细胞缺失（CD8-/-）小鼠模型，然后用RCAS-PDGFB +RCAS-STAT3处理诱导小鼠产生原发性胶质瘤，分析CD8-/-小鼠生存期变化，结果显示CD8 T细胞缺失与否，不影响荷瘤小鼠的生存期，同时不影响高级别胶质瘤的发生率（在其他肿瘤中已明确PD-1抗体是通过作用于CD8 T细胞行使抗肿瘤作用）。

2）对CD8-/-荷瘤小鼠免疫细胞群进行分析，发现脾脏和血液中的先天性免疫细胞如CD11b +细胞、小胶质细胞/巨噬细胞数量显著增加，进一步分析发现这些先天性免疫细胞的增加主要发生在肿瘤免疫微环境中，与CD8 T细胞缺失与否无关，表明先天免疫系统与神经胶质瘤发生相关，可能参与了抗肿瘤反应。

3）CD8 T细胞通常和CD4 T细胞协同作用，因此研究人员分析了CD8 T细胞缺失情况下，CD4 T细胞是否存在代偿性增加，结果显示CD8-/-小鼠血液中CD4 T细胞的比例没有变化，脾脏中比例升高。进一步对CD4 T细胞中的调节性T细胞分析，发现血液和脾脏中的比例均无变化。对细胞毒性细胞分析，发现肿瘤微环境中比例显著升高，但考虑到细胞毒性细胞在CD4 T细胞中的比例极小，因此，分析了整个肿瘤微环境中CD4细胞的变化，IHC结果显示CD4 T细胞在肿瘤中无明显变化，结果提示CD4 T细胞增加发生在外周而非肿瘤微环境。

2.2 PD-1抗体处理后抑制肿瘤的具体机制

1）对CD8-/-荷瘤小鼠进行尾静脉PD-1抗体注射处理，随后进行生存期分析，结果显示CD8 T细胞缺失与否不影响PD-1抗体处理小鼠的生存期，表明其不影响PD-1抗体的治疗效果。

2）利用多色流式细胞术从PD-1抗体处理的 CD8-/-荷瘤小鼠全脑中分离免疫细胞，分析表达PD-1的免疫细胞比例，并对其PD-1的表达量进行分析，结果显示CD11b+髓样细胞（70%，比例最高）PD-1表达水平被明显低估，NK细胞（1%）PD-1表达水平在各处理组中无差异，CD4 T细胞（5%）PD-1表达水平在各处理组间差异较大，然而进一步分析发现功能性CD4 T细胞在各组间并无差异，提示CD4 T细胞的抗肿瘤功能并不明显。

3）对另一表达PD-1的小胶质细胞/巨噬细胞进行多重免疫荧光染色分析，发现pd -1抗体处理后CD8+/+和CD8-/-小鼠小胶质细胞/巨噬细胞比例均显著下降。对剩余的小胶质细胞/巨噬细胞表型进行分析，利用Nanostring技术分析免疫相关基因的表达，随后利用GSEA进行功能分析，结果显示巨噬细胞M1表型相关基因在PD-1抗体处理组显著富集，表明剩余的小胶质细胞/巨噬细胞发生了M1极化。

4）为分析PD-1抗体对小胶质细胞/巨噬细胞的直接作用，研究人员利用PD-1抗体处理一种表达PD-1的小鼠小胶质细胞EOC-20，结果显示PD-1抗体在一定浓度时能显著抑制EOC-20的细胞活性和增殖能力，但对细胞周期没有影响。

5）研究人员进一步分析PD-1抗体是否通过ADCC机制行使作用，ADCC分析结果显示PD-1抗体处理使细胞毒性明显增强。体内重复使用大鼠抗小鼠PD-1抗体可触发抗大鼠体液反应，结果显示添加次级抗体后细胞毒性进一步增强，表明PD-1抗体通过ADCC机制消除表达PD-1的小胶质细胞/巨噬细胞。

2.3 体内分析PD-1抗体的治疗效果

为确定PD-1抗体是否能穿透中枢神经胶质瘤，将PD-1 抗体进行荧光标记，然后静脉注射到小鼠体内，结果显示小鼠大脑和全身器官中均有荧光。对手术植入胶质瘤细胞的小鼠右额叶分析发现荧光增强与肿瘤密切相关（移植瘤）。对CD8-/-荷瘤小鼠分析发现中枢神经中有多处PD-1抗体荧光，且HE染色显示荧光区含有胶质瘤，表明PD-1抗体能进入中枢神经系统穿透血脑屏障。 

3. 全文总结

关于PD-1抗体治疗，我们已有的认知是PD-1抗体可以与CD8 T细胞表面的PD-1结合，一方面解除PD-1对CD8 T细胞的功能抑制作用，另一方面解除肿瘤细胞通过PD-L1对CD8 T细胞的免疫抑制作用，从而恢复CD8T细胞的杀伤能力，起到抗肿瘤的作用。文章通过一系列的实验阐明胶质瘤中PD-1抗体可以通过另一种不依赖CD8 T细胞的机制行使抗肿瘤作用，即通过ADCC机制消除大部分表达PD-1的小胶质细胞/巨噬细胞，并使另一小部分的小胶质细胞/巨噬细胞调整为M1表型。文章提出了一个全新的PD-1抗体抗肿瘤机制，但这一机制并不完善，存在较大漏洞，小胶质细胞/巨噬细胞是免疫细胞，表达PD-1后，肿瘤杀伤能力被抑制，PD-1抗体通过ADCC机制将其消除，并只将极小部分的小胶质细胞/巨噬细胞转化为M1表型，那么对抗肿瘤细胞的是这几小部分的M1表型细胞还是有其他类型的免疫细胞去杀伤肿瘤细胞呢？文章并没有具体说明PD-1抗体处理后，肿瘤细胞是如何变化的，是如何抗肿瘤的。如果深究的话文章提出的PD-1抗体抗肿瘤新机制其实是比较片面的，不过免疫本身就是极庞大复杂的系统，想要完全理清其中的过程还是很有难度的。文章提出的新机制以及所用的研究方法还是很值得借鉴的。

4. 文中关键技术

1. Nanostring技术

每条探针都有颜色条形码，每种颜色条形码对应一个特异的目标mRNA序列。Nanostring体系中可同时进行逾八百种的颜色条形码探针和目标mRNA的杂交反应，mRNA和探针杂交后，对探针上的颜色条形码直接进行探测、计数，最后直接以数字化的形式读取mRNA定量结果。

2. ADCC分析

抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC，antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity ）是一种细胞介导的免疫防御机制，指抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与效应细胞（NK细胞、巨噬细胞等）表面的FcR结合，介导效应细胞直接杀伤靶细胞。以ADCC作用机制为原理，检测抗体是否具有ADCC生物学活性，并进一步分析抗体ADCC生物学活性的强弱已成为抗体药物研发及其质量控制过程中至关重要的一步。

ADCC活性检测常用的方法之一是乳酸脱氢酶（LDH）释放法，其原理是细胞损伤时，LDH释放至培养液，催化乳酸生成丙酮酸，使氧化型辅酶Ⅰ变成还原性辅酶，后者通过PMS还原INT形成有色甲基化合物，在570nm波长处有吸收峰，利用读取的A值，可测得效益细胞毒活性。

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