【课题套路】一文解读m6A去甲基化酶研究的课题设计思路

PD-1单抗药物在最近几年的肿瘤治疗中渐渐崭露头角，默沙东、BMS、罗氏等多家公司研发的PD-1抗体相继上市，为许多晚期癌症患者带来生机。

与化疗药物和靶向药物相比，PD-1抗体不受限于肿瘤类型，更特异地结合肿瘤细胞，治疗效果好，副作用小。然而，PD-1抗体药物同样面临耐药性的问题，严重影响治疗效果。因此，解析肿瘤的耐药机制，尽快找到新的治疗手段是当务之急。

2019年发表于《Nature Communication》的一篇研究论文就结合了当下的研究热点——mRNA的m6A甲基化，阐述黑色素瘤的肿瘤发生和对PD-1抗体耐药反应的分子机制。

一、立项依据

黑色素瘤是美国致死率最高、耐药性最强的肿瘤之一。BRAF是目前发现的黑色素瘤主要突变基因，针对BRAF突变的靶向药物使部分黑色素瘤患者获得有效治疗，但大部分黑色素瘤患者的治疗效果不佳。近年来逐渐推广的PD-1抗体免疫治疗给黑色素瘤患者，尤其是晚期患者带来了一丝曙光，然而黑色素瘤的强耐药性又成为了治疗中遇到的新问题。

尽管已有针对黑色素瘤耐药性机制展开的研究，我们对黑色素瘤抗PD-1抗体的具体分子机制仍知之甚少。因此，解析黑色素瘤对PD-1抗体的耐药机制有助于改进现有的治疗手段，提高患者生存率，具有重要的临床意义。

m6A甲基化是目前在真核细胞中发现的mRNA和非编码RNA最重要的化学修饰，在多种细胞过程，尤其是肿瘤发展中具有重要作用。m6A甲基化过程有3种甲基化酶参与：甲基化转移酶（Writer）、去甲基化酶（Eraser）和甲基化阅读蛋白（Reader）。

近期研究发现，m6A去甲基化酶FTO是白血病和胶质母细胞瘤的致癌基因，也有报道称FTO与黑色素瘤患病风险上升密切相关，但FTO对黑色素瘤发生发展的具体作用机制还未见报道。

为了探究FTO在黑色素瘤发展进程以及PD-1耐药性中扮演的角色和调控的具体分子机制，作者进行了以下预实验（研究基础）：

1. FTO与黑色素瘤相关性验证：

（1）检测FTO在不同发展阶段、不同细胞系黑色素瘤中的表达量，发现FTO在不同时期、不同细胞系的黑色素瘤中均显著高表达，在晚期黑色素瘤中表达量最高。（这里选择不同黑色素瘤细胞系检测FTO是为之后的体外细胞实验作筛选和准备，最终挑选了高表达FTO的人源细胞系Mel624和鼠源细胞系B16F10，以及和对照表达量相近的人源细胞系CHL-1）

（2）在黑色素瘤细胞中过表达上游甲基转移酶METTL3/14，细胞整体甲基化水平上升，细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降，说明黑色素瘤的发展与m6A甲基化密切相关。（甲基转移酶的作用与去甲基化酶相反，因此过表达METTL3/14应与FTO敲减后表型一致）

2. FTO靶基因预测：

（1）对FTO敲减细胞进行候选基因法、基因芯片、m6A seq、RNA seq综合分析，选出候选基因，包括PDCD1（PD-1），CXCR4，SOX10等。（此处的芯片和RNA seq结果中并没有检测到PD-1的表达，作者解释说可能是实验方法的限制，可见往往是确定目标范围之后再去组学数据中对应查找，而不是漫无目的大海捞针） 

(2) m6A-ChIP检测FTO敲减细胞中候选基因m6A水平，发现PDCD1、CXCR4、SOX10、CTSV、NOP16都显著高表达。（m6A-ChIP与ChIP类似，区别在于使用的抗体为m6A抗体，RT-qPCR检测目标基因富集量）

3. 寻找Reader蛋白：

在黑色素瘤细胞中敲减YTHDF1-3，仅在敲减YTHDF2时PDCD1、CXCR4和SOX10的表达量升高；敲减/过表达YTHDF2，细胞增殖和迁移能力增强/减弱。因此确定FTO下游的Reader蛋白是YTHDF2（YTHDF2促进mRNA降解，而YTHDF1/3维持mRNA稳定性，这一趋势与FTO和靶基因的关系一定要理清）。

基于以上研究基础，作者提出科学假说：黑色素瘤细胞中FTO高表达，降低靶基因PD-1、CXCR4、SOX10 mRNA的m6A水平，从而减少YTHDF2介导的mRNA降解，靶基因表达量升高，促进肿瘤增殖转移（具体见科学假说图）。（由于FTO上游的NF-κB和PD-1抗体响应在文中没有预实验筛选过程，因此暂时不列入假说）

科学假说图

二、研究内容

1. 体外细胞实验验证

METTL3/14/FTO/YTHDF2/PD-1信号轴促进黑色素瘤增殖转移以及FTO介导的耐药性机制

(1) 在高表达FTO的细胞系中敲减FTO，细胞增殖、迁移和侵袭能力降低；在表达量与正常细胞近似的细胞系中过表达FTO，细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著升高。

(2) FTO敲减细胞中m6A水平显著升高。（此处用到m6A斑点杂交实验）

(3) 功能回复实验：在FTO敲减细胞中继续转染：

①METTL3/14敲减载体：细胞增殖转移能力部分回复，高于FTO敲减组，但低于METTL3/14敲减组；FTO靶基因PDCD1、CXCR4、SOX10表达量与FTO敲减组相比升高。

②PD-1/CXCR4/SOX10表达载体，细胞增殖迁移能力回复，显著高于FTO敲减组。

③YTHDF2敲减载体，PDCD1、CXCR4、SOX10 mRNA的稳定性回复，高于FTO敲减组。

(4) FTO上游调控机制探索：

敲减自噬相关基因，FTO、PDCD1、NF-κB在饥饿条件下表达量显著提高；饥饿条件下敲减NF-κB，FTO、PDCD1表达量显著低于对照组。（说明FTO仅在代谢压力，即类似肿瘤细胞的生长环境下，由NF-κB通路启动上调表达）

(5) FTO对PD-1抗体免疫治疗抵抗的机制：

敲减/过表达FTO提高/降低IFNγ诱导的细胞死亡；在敲减FTO的细胞中过表达PD-1、CXCR4、SOX10能够抑制IFNγ诱导的细胞死亡。（表明FTO及靶基因参与抑制IFNγ诱导的细胞死亡通路）

2. 体内动物实验验证FTO提高黑色素瘤增殖转移能力和耐药性

(1) FTO敲减/过表达细胞皮下种植裸鼠，证实FTO能促进肿瘤增殖。

(2) 在黑色素瘤细胞中敲减/过表达YTHDF2，肿瘤生长速度变快/变慢。

(3) 敲减FTO小鼠使用PD-1抗体后肿瘤显著缩小，加入IFNγ抗体后，表型部分回复，但shFTO仍有显著缩小肿瘤效果，说明抑制FTO能有效降低黑色素瘤细胞对PD-1抗体的耐药性。

3. 技术路线 

三、总结     

本文围绕促癌基因mRNA的m6A调控，以FTO为研究对象，PD-1为明星分子，展开两条线：第一，通过验证FTO对靶基因mRNA的去甲基化作用，结合甲基化转移酶METTL3/14，甲基化阅读蛋白YTHDF2，阐述FTO在黑色素瘤细胞中高表达，促进黑色素瘤发展的机制；第二，为了探究黑色素瘤细胞对PD-1抗体的耐药性，将FTO与免疫细胞相联系，并最终发现IFN-γ诱导的细胞死亡与FTO的拮抗关系，从而从免疫角度阐明黑色素瘤细胞抗PD-1抗体的可能机制之一。

读完全文你会发现，作者并没有详细阐述所选基因（如m6A甲基转移酶、m6A阅读蛋白、IFNγ）的筛选过程，其背后可能有大量的前期研究基础和未发表的预实验作为支撑。全文逻辑清晰， 实验设计合理，工作量大，所用到的主要关键技术是m6A相关的一系列检测，实验技术较为常规，值得我们做课题设计的时候借鉴。

不足之处是文中大部分是体外细胞实验，缺乏分子之间互作的实验证据；FTO抑制IFNγ介导的细胞死亡过程从而产生耐药性的部分数据量偏少，并没有提出较为完整的机制，有待日后更多的工作来确证。              

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