连载｜间充质干细胞外泌体-如何辨别与获取
作者｜摩西 、审校编辑｜暖手同学
ID:cell-kingdomt 细胞王国出品
间充质干细胞源性外泌体：间充质干细胞通过旁分泌机制分泌的30-150nm 的微囊泡，能够借助所携带的蛋白质，microRNAs 等生物活性物质拥有介导间充质干细胞的治疗效力，在多种疾病的治疗中发挥作用。
间充质干细胞是一类拥有自我更新能力，并能够分化成骨、软骨、肌肉和脂肪等间充质组织的多潜能祖细胞，但其分化受到多种刺激的影响，如环境和机械刺激等[1]。间充质干细胞因具有免疫抑制、组织损伤修复、神经保护等多种功能，被广泛应用于如神经与心血管等多系统疾病的治疗与研究[2-3]。近年来，随着研究的不断深入，发现间充质干细胞可通过短暂旁分泌生长因子、趋化因子和细胞因子等，减少细胞凋亡和纤维化，促进血管生成和组织修复，发挥更甚于干细胞移植的治疗作用[4]。
此外，后续的临床试验也证明间充质干细胞旁分泌机制在刺激组织再生方面拥有更好的安全性与可行性[5]。2010年Lai等[6]首次证明间充质干细胞可通过旁分泌外泌体的方式介导心肌损伤期间的心脏保护作用，这提供了外泌体应用的新思路。
外泌体的来源及内含物
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间充质干细胞源性外泌体如今被广泛认为是间充质干细胞发挥生理功能的重要方式，在临床上不仅能介导间充质干细胞的治疗效力，而且在取代干细胞治疗疾病方面也具备巨大的潜力[9]。在本文小编将围绕间充质干细胞源性外泌体的起源及生物学特性、分离鉴定与保存方法这3方面进行如下综述。
间充质干细胞源性外泌体的起源及生物学特性外泌体是一类直径为30-150nm的膜性囊泡样小体，不仅包含特征性蛋白标志物如TSG101，CD9，CD63和CD81等，而且可携带包括蛋白、脂质、微小RNA和长链非编码RNA在内的各种生物分子来传递功能性遗传信息[10]。目前发现间充质干细胞是分泌外泌体能力最强的细胞[11]，其可通过特定的信号轴来调控外泌体的释放[12]，同时细胞外环境的改变也能影响间充质干细胞分泌外泌体的能力和活性[13]。利用无外泌体的血清培养间充质干细胞最终分离得到的间充质干细胞源性外泌体不仅共性表达外泌体标志蛋白如CD63，CD81等，还表达间充质干细胞的相关分子如CD29，CD44，CD90和CD73等[14]。
随着干细胞研究的进展，不断有研究证实间充质干细胞源性外泌体能够借助所携带的蛋白、非编码RNA、微小RNA等生物活性物质在多种疾病的治疗中发挥作用。新近的研究发现由富含外泌体的间充质干细胞衍生的分级分泌蛋白在肝损伤中可赋予肝脏保护作用[15]。此外，Ferguson等[16]通过对间充质干细胞源性外泌体中携带的内容物进行网络分析，不仅发现外泌体miRNA是调节心肌损伤修复的主要活性分子，而且明确其作用的生物学过程和途径。因此，目前逐渐认识到间充质干细胞源性外泌体能借助不同方式促进细胞间的信息传递和抗原呈递[17-18]、调节机体免疫应答[19]、促进细胞增殖、预防细胞凋亡、诱导血管生成、修复受损组织。
外泌体的分离鉴定与保存方法
外泌体独特的结构和临床应用的良好前景，使其逐渐成为研究的热点，而从细胞液中有效地提取并获得完整的外泌体是开展外泌体研究的前提与关键。当前外泌体的分离方法通常包括超速离心法、聚合物沉淀法、体积排阻与超滤法、免疫亲和捕获法和微流体芯片技术等，见下表。
外泌体不同提取方法的比较
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01 超速离心法
又称差速离心法是外泌体分离的标准方法，其一般步骤是先使用亚微米过滤器或低速离心法去除细胞碎片，微泡或凋亡小体；随后，以多次100000×g或更高的速度进行超速离心以消除大囊泡并使外泌体沉淀下来；最后去除上清液，在相对较少体积的缓冲液里重悬外泌体，从而得到用于研究的外泌体样品[20]。该方法虽然成本不高，但最终所得外泌体纯度低，且需要进行再提纯，回收率不稳定，故其是一个耗时耗力的过程[21]。最近也有实验将超速离心法与蔗糖密度梯度离心法组合起来用于分离低丰度外泌体[22]。
02 聚合沉淀法
目前常用的是System bioscience(SBI)研发的ExoQuickTM试剂盒，其原理是在4℃下将聚合物沉淀剂与样本共同孵育30min，低速离心后获取沉淀并用PBS重悬后获取外泌体[23]。因为其操作简单且不需要额外的实验设备，在近年来饱受青睐[24]。由于这些试剂需要过夜处理且可能存在非外泌体材料的污染和其他蛋白与聚合物的共沉淀，所以会对后续的实验分析有一定的干扰性。
03 尺寸排阻色谱法与超滤法
这2种方法均以分子大小为基础进行分离。尺寸排阻色谱法可用于血浆样品及细胞培养上清液的外泌体分离，利用装填的多孔性材料色谱柱不仅可去除大多数的白蛋白和免疫球蛋白，而且洗脱分离的外泌体在形态上是完整的，非聚集的和有功能性的。最新研究证实使用尺寸排阻层析和密度垫超速离心结合的方法来分离血液中细胞外囊泡，能显著改善细胞外囊泡与脂蛋白的分离情况，从而允许研究者对血浆外泌体的蛋白质组进行详细分析，使得血液成为发现外泌体生物标记物的可行来源[25]。超滤法是利用截留不同相对分子质量的聚醚砜超滤膜对样品进行系统性分离从而获取外泌体[26]。
04 免疫亲和捕获法
此方法是基于外泌体特异性膜抗原与抗体特异性结合进行外泌体分离，包括酶联免疫吸附实验分离法和抗体包被的免疫磁珠法。基于免疫亲和原理，研究者在分离外泌体的实验中使用ExoELISA-ULTRA完整试剂盒，即通过CD63(一种常见的外泌体标志物)进行酶联免疫吸附分离得到了来自脐带血内皮祖细胞中的外泌体[27]。Zeming等[28]利用含微米尺寸柱状阵列的确定性横向位移装置来灵敏检测纳米尺寸生物颗粒，该方法依赖于测量捕获目标生物颗粒前后聚合物珠粒尺寸或静电荷的变化，进行外泌体的分离与定量检测。磁珠法虽具备特异性高、操作简单且实验中始终维持外泌体完整形态等优点，但所分离的外泌体容易被环境中的酸碱度干扰，限制了广泛推广。
05 微流体芯片技术
这是一项新兴的技术，具有低耗容、效率快和高灵敏度等优点，在外泌体分离和分析方面拥有着广泛前景。Marczak等[29]就在实验中提出了一种新的微流控技术，通过使用压力驱动流将样品输送至微流体芯片，利用横向电场迫使它们离开交叉流并进入琼脂糖凝胶，从而过滤掉不需要的细胞碎片，而离子选择性膜通过富集效应将外泌体浓缩。这项既可以分离又可以富集回收外泌体的技术，可能会在将来早期癌症的检测中发挥重要作用。
除此之外，随着生物技术的快速发展及人们对外泌体的深入了解，不断出现分离外泌体的新方法与技术，如利用亲和性膜离心柱分离方法可从外泌体中高效分离RNA，这种方法允许一次性处理较大体积的样本(最多4mL)来有效探测低丰度RNA[30]。与传统超速离心法不同，这种技术能快速获得稳定的外泌体且可在敏感的下游得到应用。因此有理由相信越来越多分离外泌体的方法必将有效促进外泌体的深入研究和临床应用程度。
外泌体分离后进行有效鉴定是开展后续的研究或临床应用的前提与基础。目前对于外泌体的鉴定，主要方法包括流式细胞术、透射电子显微镜成像、生物免疫如SDS-PAGE/Western blot/抗体阵列技术和动态光散射技术。为避免单一技术的缺陷，研究者通常联合几种方法，同时结合外泌体的特性进行外泌体的鉴定[31-33]。
然而，需要指出的是外泌体的保存环境与保存时间对维持外泌体直径及完整性同样至关重要。Sokolova等[34]研究指出6个月内存储在-20℃环境下的外泌体即使反复冻融多次也不会发生结构变异，而4℃和37 ℃环境下储存的外泌体却存在结构降解的风险。
Cheng等[35]发现在24h内，外泌体最佳的储存温度为4℃，此时较高的温度和冻融循环可能会影响外泌体膜结构并改变其特性，引起外泌体浓度的降低；而长期储存时，-80℃的低温环境更有利于维持外泌体的完整性；然而，该实验结果还表明酸性储存环境会降低外泌体的浓度，这与其他文献中报道的酸性pH可减少外泌体相关蛋白的降解结果相矛盾[36]，故环境pH值对外泌体的影响值得进一步研究。
间充质干细胞可通过分泌外泌体发挥不同作用[47]
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小结
间充质干细胞作为一种多潜能祖细胞，不仅可以分化成中胚层谱系的细胞，还涉及内胚层和外胚层衍生的细胞，包括神经元和神经胶质细胞。相比于干细胞疗法，间充质干细胞源性外泌体治疗也具有许多优点。外泌体是脂质结合的纳米级囊泡，在治疗神经系统损伤疾病时，可自由透过血管壁穿过血脑屏障，而间充质干细胞不能随意的循环；其次，外泌体可被修饰来加载分子药物，且具有较少不良反应和免疫原性，并能在长久的储存过程中维持活性（即用即得）。然而，作为一种新的治疗手段，间充质干细胞源性外泌体治疗在临床应用过程中依然面临诸多挑战，例如需不断改进和标准化外泌体分离纯化方法，确保外泌体的临床应用安全性；增强临床应用的可比性和重现性等。
从理论上讲，基于间充质干细胞的治疗优点是它能够可持续的适度释放营养因子，故寻找具有足够数量和质量的稳健且可扩展的细胞来源以产生外泌体是间充质干细胞源性外泌体临床应用的关键。
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