综述｜牙科干细胞衍生外泌体的转化和临床应用
前言 /
间充质干细胞 (MSCs) 具有自我更新和多能性的特性，是组织修复和再生中很有前途的种子细胞。然而，越来越多的证据表明，MSCs主要通过分泌外泌体来发挥生物学功能。外泌体包含RNA、蛋白质、脂质和代谢物，是调节许多基本过程的新参与者，并在再生医学中发挥重要作用。
外泌体不仅可以模拟其母细胞的作用，还具有载药量高、免疫原性低、生物相容性好、副作用低等诸多优点。目前，共有6种不同的牙科干细胞 (DSC)，包括牙髓干细胞 (DPSC)、脱落乳牙干细胞 (SHED)、牙周膜干细胞 (PDLSC)、牙囊祖细胞 (DFPC)、根尖乳头干细胞 (SCAP) 和牙龈间充质干细胞 (GMSC) 已被分离和鉴定。DSC衍生的外泌体 (DSC-Exos) 积极参与细胞间通讯、抗炎、成骨、血管生成、免疫调节、培养神经元和促进肿瘤细胞凋亡。
间充质干细胞 (MSCs) 是多能祖细胞，可从不同组织中分离，包括但不限于骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带、毛囊、腭扁桃体、羊水等。越来越多的证据表明，MSCs能够自我更新、多向分化，调节免疫和炎症反应，抑制细胞凋亡和氧化应激等。更重要的是，大量临床前研究表明，MSCs有望治疗多种疾病，包括癌症、肝病、软骨修复、心力衰竭、中风、神经系统疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、杜兴氏肌营养不良症、眼部疾病等。
在过去的十年中，已经进行了1000多项基于MSC的临床试验，招募了大约50,000名患者。有趣的是，越来越多的证据表明，移植的MSCs的治疗效果很大程度上取决于MSCs的分泌组而不是MSCs本身。与其他类型的细胞疗法不同，基于MSC的疗法不仅通过细胞与细胞间的直接接触，而且通过释放分泌物衍生的生物活性因子来实现治疗效果。最近，MSC分泌的细胞外囊泡 (MSC-EV)，包括外泌体、微泡和凋亡小体，已被建议作为MSC可行的无细胞治疗替代品。
与细胞疗法相比，基于MSC-EVs的疗法具有许多优点，例如高载药量、高特异性、低免疫原性、优异的生物相容性、高稳定性、无细胞毒性、有竞争力的价格和有效的细胞间通讯。因此，基于MSC-EVs 的疗法，尤其是使用外泌体，已成为组织修复和再生的有前途的治疗工具。在本文中，我们重点关注源自牙科干细胞的外泌体（DSC-Exos）在治疗口腔和全身疾病方面的潜在价值。
牙科干细胞和外泌体的特性
牙科干细胞 (DSC)
目前，共有六种不同的牙科干细胞（DSCs），包括牙髓干细胞（DPSCs）、脱落乳牙干细胞（SHEDs）、牙周膜干细胞（PDLSCs）、牙囊祖细胞（DFPCs）、干细胞根尖乳头 (SCAPs) 和牙龈间充质干细胞 (GMSCs) 的分离和鉴定。
DSC-Exos 在牙组织再生、神经再生、血管生成、骨再生、抗炎和免疫调节方面具有广阔的前景。
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DPSCs，第一个被表征的DSCs，于2000年从人类牙髓中分离出来。DPSCs的MSC样特性使其能够分化为神经样细胞、成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等多种细胞谱系，并在体内形成矿化组织、血管和神经组织。此外，DPSCs也被证明可以再生牙本质和具有血管和神经的功能性牙髓。
三浦等人从人类脱落的乳牙中获得的SHED，能够分化成成牙本质细胞和内皮细胞的高度增殖细胞群。移植到人的根管内后，移植的SHEDs可以分化为功能性成牙本质细胞，形成牙本质样组织。有趣的是，SHEDs在移植到小鼠脑中后仍然存活并表达神经标记物。
同样，PDLSCs根据其起源组织命名，并从牙周韧带中分离，牙周韧带是牙齿和牙槽骨之间的软结缔组织。PDLSCs是修复牙周组织的有前途的种子细胞，能够分化为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞和神经细胞。PDLSCs 在正反馈循环中与牙周炎生态位紧密相互作用。受损的PDLSCs可能会加剧破坏的牙周组织稳态，而细菌感染和随后的宿主免疫反应通过塑造牙周微环境来影响驻留PDLSCs的功能特性。
DFPCs首先从受影响的第三磨牙的牙胚周围的牙囊中分离出来，并由Morsczeck 等人鉴定。DFPCs不仅对免疫系统具有比DPSCs和SHED更好的免疫调节和抗凋亡作用，而且由于成骨相关标志物如Runx2和DSPP在DFPCs中高表达，因此表现出比SHED和 DPSCs 更强的成骨特性。此外，DFPCs 能够在体内分化为成牙骨质细胞。因此，DFSCs是牙齿硬组织再生的一种有前途的替代来源。
SCAPs从未成熟恒牙的根尖乳头中分离出来，在牙根发育和牙本质再生中起关键作用。与 DPSCs 相比，SCAPs 的高端粒酶活性使它们成为更好的牙本质再生选择。此外，SCAPs 能够在体内形成牙骨质/PDL样复合物。此外，SCAPs已被证明具有低免疫原性并具有免疫调节功能，这使其成为一种有吸引力且有前景的组织再生治疗工具。
GMSCs首先从健康牙龈组织中分离出来，并由Zhang等人于2009年进行表征。GMSCs 可以分化为脂肪细胞、软骨细胞和内皮细胞，并在神经再生方面显示出巨大的潜力。此外，GMSCs在体外和体内均对口腔癌细胞发挥抗增殖和促凋亡作用。
据我们所知，在分子水平上区分DSC的各种来源仍然极其困难。所有不同类型的DSC都源自迁移的神经嵴细胞（神经嵴细胞是一组生命周期短暂的多能细胞，在诱导下迁移并产生各种细胞谱系：黑色素细胞、颅面细胞、软骨细胞、骨细胞、平滑肌细胞、外周和肠神经元及胶质细胞），这些细胞起源于胚胎外胚层胚层。成纤维细胞样DSC具有相似的表面标志物表达谱，并具有高克隆潜力和多能分化能力。最近的一项研究表明，钙网蛋白可能是区分 DPSC和GMSC的有前途的生物标志物。我们在表1中总结了每种类型的DSC的相似性、优点和缺点。
每种类型 DSC 的共同和不同属性
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外泌体
外泌体是直径在40-100nm的盘状囊泡，它们大量存在于包括母乳、唾液、血液和尿液在内的体液中，这种类型的细胞外囊泡最初被认为是废物。然而，越来越多的证据表明，外泌体携带许多生物活性分子，包括核酸、蛋白质、脂质、代谢物。这些封装的材料被选择性地运输到邻近或远处的细胞，这有助于细胞间通讯、信号转导、免疫反应调节、抗原呈递和受体细胞的表观遗传重编程。外泌体的提取方式主要包括：超速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、PS亲和法、色谱法等六种。外泌体的生物学功能在很大程度上取决于外泌体分泌时起源组织或细胞的生理/病理条件，以及受体细胞的表面受体。如图所示图1B，DSC衍生的外泌体可能代表组织修复和再生以及治疗其他全身性疾病的理想治疗工具。
牙科干细胞衍生外泌体的
转化与临床应用
DPSC-Exos
DPSCs衍生的外泌体 (DPSC-Exos) 的高骨/牙诱导能力和易用性使其在再生医学中极具吸引力。此外，衰老的 DPSCs 仍具有活跃的细胞代谢并分泌可穿透血脑屏障的功能性外泌体，表明 DPSC-Exos 可能是治疗各种疾病的有效药物载体，尤其是帕金森病 (PD) 等神经系统疾病。例如，DPSC-Exos 被认为是传递肿瘤抑制因子 miR-34a 以抑制乳腺癌细胞增殖的合适载体。在牙源性分化方面，Huang 等人揭示 DPSC-Exos 通过与基质蛋白（如纤连蛋白和 I 型胶原蛋白）结合而附着在生物材料上。此外，DPSC-Exos，尤其是从牙源性分化环境下培养的 DPSCs 中分离的那些，在体外增加了幼稚 DPSCs 牙源性分化必不可少的基因的表达，并促进了体内牙髓样组织的再生。
DPSC-Exos还具有很强的抗炎和免疫调节作用。例如，DPSC-Exos通过递送外泌体 miR-1246促进牙周炎小鼠模型中的牙槽骨重建和牙周上皮愈合。DPSC-Exos 通过抑制 CD4+T细胞向T辅助17细胞(Th17)的分化发挥免疫调节作用，并促进CD4+T细胞向调节性T细胞 (Tregs) 的转化，导致抗炎细胞因子水平升高。除了口腔疾病，基于DPSC-Exos 的疗法有望用于治疗全身性疾病。例如，与来自骨髓或脂肪组织等中胚层组织的MSC相比，DPSC衍生的外泌体可能更适合治疗神经退行性疾病。过表达miR-140-5p的DPSCs分泌的外泌体促进与软骨分化相关基因的表达，并在体外和体内发挥抗凋亡作用，这代表了一种潜在的骨关节炎治疗新策略。
SHED-Exos
SHE衍生外泌体（SHED-Exos）的应用可分为以下三类：促进成骨、神经营养和抗炎功能。在成骨方面，SHED-Exos通过上调与成骨相关的关键基因和信号通路促进PDLSCs的成骨分化。SHED-Exos被证明具有动员初始BMMSC的能力，从而增强骨再生。魏等人揭示 SHED-Exo 通过减少脂滴和脂肪生成标志物PPARγ 的表达促进骨生成并抑制骨髓间充质干细胞 (BMMSCs) 的脂肪生成。SHED-Exos 促进HUVECs 的新生血管形成和BMMSCs 的成骨分化，并且这种调节作用可以通过添加AMPK 抑制剂来抵消，表明AMPK信号通路可能参与介导 SHED-Exos 的促血管生成作用和促骨再生活动。
关于神经营养特性，将 SHED-Exos 注射到创伤性脑损伤 (TBI) 大鼠模型中，并观察到SHED-Exos 通过改变小胶质细胞极化有助于大鼠运动功能恢复和皮质损伤减少。纳布特等人研究表明SHED-Exos 显著改善了单侧6-羟基多巴胺 (6-OHDA) PD大鼠模型的步态障碍和对侧躯体障碍。总的来说，SHED-Exos是治疗PD等神经系统疾病的有前途的治疗工具。在抗炎作用方面，SHED-Exos 显着抑制体内角叉菜胶诱导的急性炎症。同样，罗等人表明SHED-Exos通过递送miR-100-5p显着减少了源自颞下颌关节的软骨细胞的炎症。
PDLSC-Exos
PDLSCs 衍生的外泌体 (PDLSC-Exos) 的主要调节功能包括血管生成、抗炎和成骨。炎症导致PDLSCs外泌体分泌增加，炎症PDLSC来源的外泌体通过上调血管特异性标志物CD31和VEGFA的表达促进HUVECs的血管生成。从暴露于LPS（脂多糖）诱导的牙周炎环境的 PDLSCs 中分离的外泌体，通过miR-155-5p/SIRT1通路调节T辅助细胞17（Th17）/调节性T细胞（Treg）的平衡，表现出良好的抗炎能力。
在成骨而言，PDLSC-的Exos具有用于诱导的BMMSCs的成骨分化的能力。通过调节AMPK 信号、MAPK 信号和胰岛素信号通路。P2X7R 过表达 PDLSCs 衍生的条件培养基和外泌体，通过传递miR-3679-5p、miR-6515-5p和 miR-6747-5p，显着提高了炎症微环境中PDLSCs 的成骨能力。有趣的是，在PDLSCs 的成骨分化过程中，PDLSCs-exos 中的 circRNA 和 lncRNA 表达谱发生了显着改变，表明外泌体非编码RNA可能在调节PDLSCs 成骨中发挥关键作用。总的来说，PDLSC-Exos 通过促进增殖、血管生成和成骨以及调节炎症反应，有利于维持牙周稳态。
SCAP-Exos
SCAP 衍生的外泌体 (SCAP-Exos) 也显示出口腔组织再生的巨大潜力。庄等人证明 SCAP-Exos在体外和体内促进了 BMMSCs 的牙本质生成，表明 SCAP-Exos 可能代表牙本质-牙髓复合体再生的潜在治疗工具。SCAP-Exos通过注射入小鼠腭牙龈复合体临界尺寸缺陷（CSD），显着改善血管生成和软组织再生。在机制上，SCAP-的Exos促进filopodium形成，迁移和血管内皮细胞的细胞骨架重组经由提供外泌体Cdc42。王等人比较了 SCAP-Exos 和 BMMSC-Exos 之间的 piRNA 表达谱。发现差异表达的piRNA与许多重要的生物学功能密切相关，如催化活性、代谢过程、细胞过程、结合和生物调节，表明piRNA可能在调节外泌体的分子活性中发挥关键作用。
GMSC-Exos
尽管目前关于GMSC-Exos 的潜在治疗应用的研究很少，但它们对组织再生有很大的希望。发现用 GMSC-Exos 处理的前成骨细胞 MC3T3-E1深茜素红染色，ALP活性增加，成骨基因表达上调，表明GMSC-Exos 促进了 MC3T3-E1 的成骨分化。从肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 预处理的 GMSC-Exos 中分离的外泌体通过改善 GMSC-Exos 的分泌和增加外泌体 CD73 的表达来诱导抗炎 M2 巨噬细胞的极化。在高脂微环境中，GMSC-Exos 抑制脂质积累，将促炎巨噬细胞转化为抗炎表型，并减少炎症因子的分泌和表达，包括 IL-6、IL-1β、TNF-α 和簇分化。此外，GMSC-Exos 通过传递 miR-1260b表现出抗破骨细胞活性并抑制炎症性骨丢失。
饶等人将 GMSC-Exos 与可生物降解的几丁质导管结合，并将复合材料注射到大鼠坐骨神经缺损模型中。结果表明，GMSC-Exos促进雪旺氏细胞（一种周围神经的胶质细胞，为轴突提供支持，并且形成髓鞘）的增殖和背根神经节神经元轴突的生长，促进神经纤维和髓鞘的形成，从而有助于恢复运动技能、神经传导功能和肌肉运动。GMSC-Exos 还通过促进糖尿病大鼠皮肤缺损模型的再上皮化、胶原重塑、血管生成和神经生长来促进糖尿病皮肤缺损的愈合。GMSC-Exos与小肠黏膜下层-细胞外基质相结合促进大鼠舌缺损模型中的味蕾再生和舌乳头恢复。我们总结了有关DSC-Exos 潜在临床应用的当前可用证据（表 2）。
DSC-Exos临床应用的潜在价值
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未来展望与挑战
DSC-Exos在组织修复和再生以及治疗其他疾病方面具有广阔的前景。然而，据我们所知，仍然没有足够的证据来评估和比较不同类型DSC-Exos之间以及DSC-Exos 与其他 MSCs-Exos 之间的分子差异、生物学功能和治疗应用。与源自其他MSC 的外泌体相比，DSC-Exos 可能具有自己的优势。例如，DPSC-Exos 比 BMMSC-Exos 具有更强的免疫调节、抗坏死和抗凋亡作用。当前可用的证据表明 DSC-Exos 可能具有类似的局限性和弱点。与来自BMMSCs和脂肪组织来源的MSCs的外泌体相比，足够量的 DSCs-Exos 的分离仍然是阻碍其治疗应用的障碍。
更重要的是，与来自骨髓抽吸物的自体BMMSC相比，DSCs主要来自不可再生的脱落乳牙、第三磨牙、正畸治疗和不可逆牙周炎拔除的牙齿，或牙科手术后的废弃组织。因此，在需要时及时获得 DSC-Exos 具有挑战性。只有在预先将脱落的乳牙和第三磨牙等不必要的组织以稳定和长期的方式储存的情况下，DSC-Exos的应用才有可能大规模推广。此外，DSCs-Exos的储存、运输和大规模生产缺乏标准化和公认的方法，严重影响了其临床应用。
总结
DSC主要通过旁分泌机制分泌外泌体来发挥治疗作用。与DSCs相比，DSC-Exos具有独特的优势，如载药量高、特异性高、免疫原性低、生物相容性好、易获得、副作用小、纳米尺寸等。此外，DSC-Exos已被证明可以调节许多重要的生物学过程，包括细胞间通讯、抗炎、成骨、血管生成、免疫调节、培养神经元和促进肿瘤细胞凋亡。尽管转化为临床实践仍有许多障碍，但DSC-Exos正在成为一种有前途且实用的组织修复和再生治疗方法。
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