从SARS到SARS-CoV-2，辉瑞新冠口服药物的分子设计

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辉瑞的新冠口服药物PAXLOVID™（核心成分为PF-07321332）展现了惊人疗效，今天给大家分享下其研发历程。PF-07321332的研发故事得追溯到辉瑞在SARS期间发现的PF-00835231。当时辉瑞已经研发出PF-00835231，但随着SARS在2003年的结束，临床研发终止了。

偶然？17年前的沉寂分子焕发新生

Rupintrivir是人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶抑制剂（1999年发现），随后有科学家解出了TGEV（冠状病毒的一种）M^pro与rupintrivir的共晶结构。TGEV的晶体结构曾被用来同源建模SARS的3CL蛋白酶结构，当时有科学家认为rupintrivir有可能会是设计SARS的3CL蛋白酶抑制剂的先导化合物。然而，辉瑞的研究人员发现rupintrivir对SARS的3CL蛋白酶活性很弱。以rupintrivir为起点，在保留Michael acceptor的基础上，研究人员随后优化得到活性还可以的SARS-mol2分子（本质是替换了合适的氨基酸侧链）。最后，对SARS-mol2经过一系列的SAR优化得到共价抑制剂PF-00835231（见图2或图3的化合物1）。2020年新冠爆发时，辉瑞发现SARS和SARS-CoV-2病毒的3CL蛋白酶在与底物结合的催化域中的序列100% 相同，因此重新捡起了这个17年前的分子继续研发。 

图1. Rupintrivir与SARS-mol2的分子结构。

图2. SARS-CoV-2-3CL蛋白酶与PF-00835231（和Cys145共价结合）的共晶结构（PDB：6XHM）。From: JMC

分子优化得到PF-07321332

如图3所示，PF-00835231（即图3的化合物1）的活性非常好且代谢稳定，但渗透性和口服利用度都很低，导致1很难口服给药。为了改善1的渗透性和口服利用度，研究人员将1的α-羟甲基酮（因为较多氢键给体通常与口服生物利用度低有关）改为氰基得到化合物2。2的口服利用度F（1.4 vs. 7.6）和从胃肠道吸收的口服剂量分数F_a x F_g (3.3 vs. 38)都显著提高，但活性明显降低。随后，研究人员同时引入氮杂双环（模拟环状Leu）和苯并噻唑，得到化合物3。如图3所示，3的渗透性提升显著（P_app：0.207 vs. 10.3），但3的氮杂双环片段占据了疏水口袋，使其无法与Gln189形成氢键（如图4C所示），导致其活性远不如1。研究人员观察到3的吲哚片段并没有很好的占据口袋，为此他们将吲哚改为甲基磺酰胺，得到的化合物4与Gln189和Glu166都形成氢键，且各方面指标提升明显（EC₅₀=909 nM；F=10%；F_a x F_g =84）。

基于甲基磺酰胺的相互作用模式，研究者进一步优化得到含三氟乙酰胺的化合物5。5和4的K_i接近，但5的渗透性和EC₅₀比4好10倍（P_app：13.1 vs. 1.56；EC₅₀：85.3 nM vs. 909 nM），且5在老鼠和猴模型上的药代动力学表现同样优异（F分别为33%和7.9%；F_a x F_g分别为100%和66%）。最后，将5的苯并噻唑改为氰基即得到了临床分子PF-07321332（即化合物6），6的活性和生物利用度进一步提升，且通过与SARS-CoV-2-3CL蛋白酶的孵育实验发现6是可逆共价抑制剂。由于6具有便于放大合成、更好的溶解性（便于简单制剂研究毒理学）和降低差向异构化等优点，研究人员选择6进入临床。

图3. SARS-CoV-2-3CL蛋白酶抑制剂的体外和体内参数。从左到右分别为3CL蛋白酶活性K_i、抗病毒活性EC₅₀、通透性P_app、内在清除率CL_int、血浆清除率CL_p、口服生物利用度F和从胃肠道吸收的口服剂量的分数 (F_a x F_g)。

图4.（A）SARS-CoV-2-3CL蛋白酶与化合物1的共晶结构。（B）化合物3的二甲基-双环 [3.1.0]脯氨酸模型（蓝色）与亮氨酸残基（青色）的构象叠加。（C）化合物3有效地填充了由 Met49、Met165 和His41 形成的亲脂性口袋，但不能与Gln189形成有效的氢键。（D）化合物4与Gln189和Glu166都形成氢键。（E）临床候选 PF-07321332（化合物6）与 SARS-CoV-2-3CL蛋白酶结合的共晶结构。(F) Cys145与化合物6的可逆共价结合。

改善代谢得到临床药物PAXLOVID

探究PF-07321332的代谢时，研究人员发现加入CYP3A4/5抑制剂时，PF-07321332在人肝微粒体的内在消除率（CL_int）会显著下降（24.5 vs. <4.33）；而且，CYP3A4 会对PF-07321332的多个位点（如叔丁基、氮杂双环和吡咯烷酮）进行氧化代谢。这些结果表明CYP3A4对PF-07321332的代谢至关重要。为此，研究人员想通过与强效CYP3A4抑制剂利托那韦（RTV）共同给药来提高临床中PF-07321332治疗浓度。利托那韦常用作蛋白酶抑制剂（如地瑞纳韦、洛匹那韦等）的药代动力学增强剂，这些蛋白酶抑制剂也是通过CYP3A4进行代谢清除。

图5C显示了单独服用150mg PF-07321332和250mg PF-07321332+利托那韦获得的成人初步血浆浓度与时间的药代动力学曲线。PF-07321332 安全且耐受性良好，当与 RTV 共同给药时，口服血浆浓度显著增加且远高于SARS-CoV-2抗病毒的EC90 值。

图5. PF-07321332的临床前毒理学和健康成人参与者单次上升剂量暴露研究。（A）每天一次给予PF-07321332的大鼠口服毒代动力学暴露（第14天）。（B）每天两次给予PF-07321332的猴子口服毒代动力学暴露（第15天）。（C）成人口服150mg PF-07321332和250mg PF-07321332+利托那韦RTV的血浆浓度。（D）成人口服250mg PF-07321332和100mg利托那韦（t = -12、0、12小时）12小时内的血浆浓度 。

小结

PF-07321332的发现始于辉瑞在SARS期间的工作，虽然有偶然性，但充分展现了公司深厚的科研底蕴。辉瑞的科学家以拟肽rupintrivir为起点，通过替换类氨基酸残基侧链得到先导化合物SARS-mol2分子。随后经过经典的SAR得到了活性很好的PF-00835231，再基于改善口服利用度的需求优化得到PF-07321332。最后通过药代研究发现加入利托那韦能改善代谢消除率，得到临床药物PAXLOVID™。

参考文献：

1. Peter S. Dragovich, et al. "Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 4. Incorporation of P1 Lactam Moieties as l-Glutamine Replacements". J. Med. Chem. 1999, 42, 1213–1224

2. Robert L. Hoffman, et al. "Discovery of Ketone-Based Covalent Inhibitors of Coronavirus 3CL Proteases for the Potential Therapeutic Treatment of COVID-19". J. Med. Chem. 2020, 63, 21, 12725–12747

3. DAFYDD R. OWEN, et al. "An oral SARS-CoV-2 Mpro inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19". Science 2 Nov 2021

DOI: 10.1126/science.abl4784

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作者：林康杰

审稿：王世伟

编辑：林康杰

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