Science：拟南芥根系三萜化合物塑造特异的微生物组
https://science.sciencemag.org/content/364/6440/eaau6389
文章新闻稿
2019年5月10日，中科院遗传发育所白洋组与JIC的Anne Osbourn组合作在拟南芥代谢物调控根系微生物组领域取得重大突破，成果以Article形式于5月10日在线发表于Science杂志，海南大学罗杰教授对本工作的意义进行点评。详细报导请点击下方链接：
文章简介
RESEARCH ARTICLE SUMMARY
拟南芥特异代谢网络选择性调控根系微生物组
A specialized metabolic network selectively modulates Arabidopsis root microbiota
背景INTRODUCTION: 植物进化和适应的特征之一是产生特殊的代谢物。植物特有的代谢产物具有生态功能，介导植物与其环境的相互作用。虽然微生物可以对植物生长和适应性产生多方面的影响，但植物如何组装和调节其微生物组尚不清楚。了解这一过程背后的影响因素和机制将为可持续农业和植物微生物组工程开辟道路。据估计，植物利用大约20%的光合产物碳源来制造根源性有机分子。然而，是否（如果是的话，哪一种）专化的代谢物能够指导特定的根微生物群的组装仍然未知。
理性RATIONALE: 三萜类化合物是植物特异的代谢物，它们的功能包括在植物防御、信号，及抗微生物活性。它们是植物天然产物中数量最大且结构最多样的家族之一。小芥菜类植物拟南芥基因组包括四个根系特异表达而途径未知的三萜生物合成基因簇。植物生物合成基因簇是在强大的选择压力下形成，生产的相关小分子在生物的进化和生态中起重要作用。已有研究表明这些拟南芥的基因簇在应对病原体的防御反应中起作用，表明这些三萜合成基因簇可能调控拟南芥根系微生物组。
结果RESULTS: 我们已经阐明了一个拟南芥根特异表达的代谢网络，它由功能上不同的三萜生物合成基因簇组成，并由外部分散的基因参与，它们主要编码多种酰基转移酶和乙醇脱氢酶。这个代谢网络具有合成50多种以前未知的根系代谢产物的潜力。考虑到我们检测到的非挥发性根系代谢物总数（约300种）是一个相对较大的数字。我们对三种不同的根系三萜代谢产物的生物合成途径进行了鉴定：拟南芥宁素(thalianin)、拟南芥宁基脂肪酸酯(thalianyl fatty acid esters)和拟南芥啶素(arabidin)。对拟南芥这些化合物的生物合成突变体的根微生物组的分析表明，与野生型相比它们的根微生物组成和多样性发生了变化。与分类上较远物种水稻和小麦的根系细菌分布相比较，支持这种特殊的三萜生物合成网络在介导拟南芥特定微生物组建立中的作用。接下来，我们在体外测试了纯化的拟南芥根系三萜化合物和具有代表性的三萜混合物对从拟南芥根系微生物组中分离出的19个分类多样的细菌菌株活性的影响。发现这些化合物确实可以选择性地调节这些细菌的生长，正调控和负调控的例子很明显。不同三萜类化合物对不同菌株生长的调节作用与拟南芥Col-0和三萜突变体根中不同菌种的相对丰度差异相关。此外，还发现一些根系细菌能够选择性地代谢某些三萜类化合物（如拟南芥脂肪酸酯），并利用分解产物作为碳源进行增殖。
结论CONCLUSION: 我们证实拟南芥产生一系列特殊的三萜类物质，指导拟南特异性微生物组的建成与维持，使其能够根据自身目的来塑造和调整根内和根周围的微生物群落。我们推测，植物界内的代谢多样性可能为塑造微生物组适应宿主需求中提供了交流和识别的基础，可以部分解释植物特异代谢物存在意义。本研究为植物根系微生物组工程化提供了机会，为研究根系微生物组在植物生长和健康中的作用奠定了基础。
拟南芥生物合成基因簇衍生的三萜类代谢产物动态调控根系微生物组
三萜类特异性的拟南芥宁素(thalianin)、拟南芥宁基脂肪酸酯(thalianyl fatty acid esters)和拟南芥啶素(arabidin)通过促进（橙色和紫色细菌）或抑制（蓝色细菌）不同细菌类群的生长。在某些情况下可作为碳源（紫色细菌）。这些三萜类化合物是由生物合成基因簇和非成簇基因编码生物合成途径的产物。彩色箭头表示编码不同类型酶的基因：黑色，三萜合酶；红色，细胞色素P450s；紫色，酰基转移酶；蓝色，乙醇脱氢酶。这些特殊三萜化合物介导根系细菌的动态调节有助于形成拟南芥特异的根系菌群。
拟南芥特异代谢网络选择性调控根系微生物组
A specialized metabolic network selectively modulates Arabidopsis root microbiota
Ancheng C. Huang(黄安诚)1, Ting Jiang(姜婷)2,3,4, Yong-Xin Liu(刘永鑫)2,3, Yue-Chen Bai5,6, James Reed1, Baoyuan Qu(曲宝原)2,3, AlainGoossens5,6, Hans-Wilhelm Nützmann1†, Yang Bai(白洋)2,3,4‡, Anne Osbourn1‡
英国英国约翰英纳斯中心，生物代谢中心(Department of Metabolic Biology, John Innes Centre,
Norwich Research Park, Colney Lane, Norwich NR4 7UH, UK.)中国科学院，遗传与发育生物学研究所，植物基因组国家重点实验室(State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Science, Beijing, China)
中国科学院-英国约翰英纳斯中心植物和微生物科学联合研究中心 (CAS-JIC Centre of Excellence for Plant and Microbial Science (CEPAMS), Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences (CAS), Beijing 100101, China)
中国科学院大学，现代农学院 (University of Chinese Academy of Sciences, College of Advanced Agricultural Sciences, Beijing 100039, China)
比利时根特大学，植物生物技术与生物信息学院 (Ghent University, Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent 9052, Belgium)
比利时，VIB植物系统中心 (VIB Center for Plant Systems Biology, Ghent 9052, Belgium)
代表共同第一作者；‡ 代表共同通讯作者。
摘要
植物特有的代谢产物具有生态功能，但植物基因组中存在许多未被描述的生物合成基因的分子功能仍然未知。我们在植物拟南芥的根部发现了一个三萜类化合物生物合成网络。总的来说，我们已经阐明并打通了三种不同的根系三萜类化合物的生物合成途径，即拟南芥宁素（thalianin，七步）、拟南芥宁基中链脂肪酸酯（thalianyl medium-chain fatty acid esters，三步）和拟南芥啶素（arabidin，五步）。在拟南芥这些化合物的生物合成突变体中改变了根系微生物组。利用纯化的化合物进行体外生物实验，揭示了这些途径代谢产物对根微生物组成员的选择性生长调节活性及细菌对其的生化转化和利用，支持了这种生物合成网络在拟南芥特定根系微生物群落形成中的作用。
背景
植物已经进化出产生大量特异代谢物的能力，很可能是为适应不同环境生态位的需要所驱动（1）。影响植物健康和适应性的一个关键环境因素是根系微生物组（2-4），然而支持建立特定根系微生物组以及植物如何引导根系周围微生物群落组装的机制仍然未知。据估计，植物利用大约20%的光合碳来制造根源性有机分子，刺激周围土壤形成独特的根系微生物组（5-8）。然而，植物产生的特殊代谢产物是否，以及哪些可以调节根微生物组尚不清楚。在植物基因组中存在大量没有研究的根系特异表达的生物合成基因，也表明我们对这些通讯过程的理解仍很不完整。
三萜类是一类特殊的植物代谢产物，具有重要的植物防御和信号传导功能。它们是植物天然产物中规模最大、结构最多样的一个家族，许多已被证明具有抗真菌和抗菌活性，这表明它们在调节植物和微生物之间的相互作用中具有潜在作用（9-11）。三萜类化合物是通过甲羟戊酸途径合成的，第一步是由三萜合酶（TTSs）进行的，这种酶可以合成不同的三萜骨架（12）。在拟南芥生态型Col-0的基因组中有13个预测的TTS基因，其中5个（MRN, THAS, ABDS,
PEN3和BARS）位于染色体4和5号上的4个植物生物合成基因簇中（图1A）。
植物生物合成基因簇代表了在强选择压力（13）下进化的基因组热点，有可能编码具有生态上重要性的代谢物（14）。此外，这四个拟南芥生物合成基因簇中的大多数基因都是根系特异表达的（图1B），而拟南芥比醇(arabidiol)基因簇与防御根腐病菌不规则腐霉(Pythium irregulare)有关，这表明衍生的代谢产物可能在根与微生物的相互作用中起作用（15-18）。拟南芥生物合成基因簇的TTSs似乎共享一个共同的祖先，但在功能上有分化，形成一个与其他拟南芥TTSs不同的单系分支（图S1）（15）。这些成簇的TTSs通过将普遍存在的前体2,3-氧喹啉转化为不同的三萜骨架，特别是marneral/
marnerol M1/M2（19）、拟南芥宁醇（thalianol） T1（20）、拟南芥比醇(arabidiol) A1（21）、tirucalladienol Tr1（22）和baruol B1（23），通过相应的双环/三环/四环载体将初级代谢产物转化为特异的代谢产物（图S1）。这些成簇区域的13个细胞色素P450（CYP)基因中的4个（At5g48000 (THAH), At4g15330(CYP705A1), At5g62590 (MRO),和At5g36110(CYP716A1)，分别属于CYP708, CYP705,CYP71, 和CYP716家族）先前已经被证明主要将T1、A1、M1/M2和Tr1转化为3b,7b-thaliandiol T2, 14-apo-arabidiol A2, 23-hydroxy-marner-al/ol M3/M4和未知产物（图2）（18、24）。然而，在这些生物合成基因簇中存在许多未知但具有预测功能的基因，它们在拟南芥根中的与TTS和CPY基因共表达（图1B和图S2）（15、18）。在这里，我们阐明了三种来源于thalianol和arabidiol基因簇的生物合成途径，它们在根中特异表达特异代谢物，在体内和体外选择性调节拟南芥根系细菌中起着重要作用，并对拟南芥特异性根微生物组的建立过程中起重要作用。
结果
图1. 拟南芥中鉴定根系特异表达的三萜生物合成网络
Fig. 1. Identification of a root-expressed triterpene biosynthetic network in A. thaliana
(A) 四个拟南芥生物合成基因簇和外围基因。已知的编码基因标为实心色，末知功能的标记为点。TTSs黑色，CYP705家族红色，CYP708家族橙色，CYP71家族棕色，CYP716家族黄色，CYP702家族深黄色，酰基转移酶ACTs绿色，乙醇脱氢酶ALDHs蓝色；非生物合成基因灰色。分散和外围鉴定的基因作为网络的一部分也展示出来。共表达基因有亮蓝色的边缘。PEN3之前报导在根中与其它基因簇共表达。
(B) 三萜基因簇和分类/外围相关合成基因在不同组织中的表达。热图基于芯片表达数据，使用eFP浏览器生成。为清晰表达，相同组织来自不同发育阶段仅标出组织名称。更详细的热图见附图1。
解析三萜基因簇的代谢通路
Elucidation of the thalianol gene cluster–derived pathways
拟南芥中三萜类化合物(thalianol)生物合成基因簇包含4个共表达基因，其中两个基因（TTS THAS和CYP THH）的功能已知（15，24）。属于CYP705家族的第二个CYP (THAO, At5g47990)介导该途径的第三步，但尚未确定所得产物的精确结构（15）。第四个基因（THAA1, At5g47980）与其他途径基因共表达，被预测编码属于BAHD家族的酰基转移酶，但其功能未知（15，25）。我们利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达来研究簇基因THAO和THAA1（26-28）的功能。我们首先以组合方式将THAS与编码羟化酶（THAH）、CYP705A5（THAO）和酰基转移酶（THAA1）的其它三个共表达簇基因在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中瞬时表达（表S1）。我们发现，当与THAS共存时，仅THO就可以修饰thalianol，得到两个新的产物3b,16-thaliandiol T3和16-keto-thalianol T4（图2和图S3）。THAO和THAH与THAS共存时，主要产物是16-keto-3b,7b-thaliandiol T5和16-keto-3b,7b,15-thaliantriol T6，而不是先前提出的去饱和二氢大麻酚（图2和图S3）（15）。此外，我们发现THAA1编码一种酰基转移酶，只有当与所有其他三个簇基因（THAS, THAH,和 THAO）共存时才具有功能，产生一种新的产物，被鉴定为3b,7b-dihydroxy-16-keto-thaliayl acetate T7，连同其作为次要产物的C17=C18顺式异构体cis-T7（图2和图S3）。这表明，在THAS、THAH和THAO作用为在该位置安装羟基部分后，之后THAA1在thalianol骨架的C15位置添加乙酸基团。我们还鉴定了另一个BAHD酰基转移酶基因（THAA2，AT5G47950），该基因与五号染色体上的THAA1非常接近，与thalianol基因簇共表达（图1）。与THAA1相比， THAA2是混杂的，当与thalianl簇基因亚群共存时，它可以作用于不同的thalianl衍生化合物（T1到T7）的C3羟基部分，引入乙酰基（T11到T17）（图2、图S4和表S1）。我们的研究结果表明，四个thalianol簇基因和附近的共表达基因THAA2在本氏烟中共表达时产生7b-hydroxy-16-ketothalian-3b-15-yl diacetate T17。
图2. 拟南芥根的三萜生物合成网络
Fig. 2. The triterpene biosynthetic network in A. thaliana roots
Transformations catalyzed by TTSs are shaded gray, clustered CYPs are shaded red, and other tailoring enzymes are shaded blue. Chemical diversification of pathway scaffolds and intermediates by promiscuous acyltransferases and alcohol dehydrogenases is highlighted in the black box, bottom right. DMNT, (E)-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene. Black arrows, known transformations; orange and burgundy red arrows, newly characterized steps in the thalianin and arabidin pathways, respectively; cyan arrows, pathway diversification by promiscuous enzymes; dotted black arrow, unknown transformation. The enzymes for each step are colorcoded to match the classes of enzyme shown in Fig. 1A, with the exception that all CYPs are in red.
鉴定拟南芥根系拟南芥宁醇(thalianol)衍生代谢物
Identification of thalianol-derived root metabolites in Arabidopsis
我们采用靶向的代谢组分析，在拟南芥中鉴定拟南芥宁醇衍生代谢物，共在野生型和过表达根系中提取了7个主要的thalianol衍生代谢物，同时在突变体中不存在(图3A-C，附表2)。这不是我的领域，此略过N个字，详见原文。
图3. 不同拟南芥株系的代谢分析
Fig. 3. Metabolite analysis of roots of different Arabidopsis lines.
(A) GC-MS比较不同拟南芥野生型和三萜网络突变体根系提取物中的成分。
(B) 对（A）中组分进行提取离子色谱图（EICs)分析
(C) 野生型和突变体全根检测三萜通路代谢物。
(D) LC-MS确定根系提取物中化合物T9和T10的含量
鉴定thalianin、TFAEs和arabidin通路的缺失基因
Identification of missing genes for the biosynthesis of thalianin, TFAEs, and arabidin
为鉴定合成T9和T10的缺失 基因，我们采用全基因组基因共表达分析数据库ATTED-II(http://
atted.jp)挖掘与我们发现的4个thalianol基因组共表达的基因。选最相近的20个候选基因组，在本氏烟中进行共表在实验（附表2），我们鉴定到了At3g29250 (THAR1) 和At1g66800 (THAR2)。这不是我的领域，此略过N个字，详见原文。
三萜生物合成影响拟南芥根系微生物组的组装
Triterpene biosynthesis affects Arabidopsis root microbiota assembly
在烟草体系中重建了thalianin T10, arabidin A5, TFAEs T18a 和 T18b的完整生物合成通路，下一步将研究这个代谢网络的潜在生物学功能。thalianin T10和 arabidin A5通路基因在根上皮(epidermis)、中柱鞘(pericycle)或中柱(stele)(附图15)。thalianol通路化合物T1, T2, T9, T10,和arabidin A5 可以在根表蜡质中提取，T9和T10在水培的幼苗分泌物中提取(附3D/E，附图16)。thalianin和arabidin都在茉莉酸处理下上调表达(附图17)，暗示它们可能在与根际微生物互作中起作用。
我们选择thalianin(T10), TFAE(T18a-T18c)和arabidin(A5)通路的突变体 (thas-ko1, thas-ko2, thah-ko, thao-ko, thaa2-ko和 thaa2-crispr)和野生型(Col-0)用于根系微生物组分析(附表2)。采用无偏大量靶向的代谢组分析整个根系的提取物、根表提取物和突变体与野生型的分泌物(附图18-22)。我们在北京昌平农场的土壤中种植这些株系，实验室温室中生长6周。收获的根系先用磷酸盐缓冲液(PBS, phosphate-buffered saline)冲洗掉土壤颗粒和松散结合的微生物，然后基于之前的方法进行16S rRNA基因测序。在收获时野生型和突变体表型无明显差异。然后，我们发现突变体与野生型相比，根系微生物组结构存在差异。有监督的主坐标轴分析(CPCoA)展示了野生型与突变体根系微生物组的差异(可以解析16.5%的总体变异，多元变量置换检验 P < 0.001，图4A，附表18-22)。存在两个独立来源的突变体THAS (thas-ko1和
thas-ko2) 和THAA2 (thaa2-ko和thaa2-cripsr)表现出相似的代谢缺陷（附图18-22）也同样拥有相似的微生物组成和多样性（图4A，附图23，表23-26）。此外，所有的突变体与野生型相比，表现出相似的样式，如Bacteroidetes富集，Deltaproteobacteria下降和相似的OTU变异样式(图4B，附图24-25，附表27-44)，这一结果与来自三萜同一生物合成通路的多基因一致。这些OTUs在突变体中也表现出共同上调或下调的趋势，93%（30个中的28个）的OTUs在根系比土壤中富集，表明了拟南芥根系对细菌的特异选择（附图26，附表45-46）。这些数据表明三萜生物合成网络在根系微生物组装和建立过程中起重要作用。
为进一步理解代谢网络对拟南芥特异微生物的调节，我们在比较突变体与野生型间的以及在昌平土壤种植的远缘物种水稻、和小麦根系微生物组的分类学差异。尽管拟南芥、水稻和小麦样本在许多方面存在差异，如生成条件，萌发条件，气候等(见补充材料和方法)，但起始土壤非常相近，存在67%共有的OTUs(3531个中的2377个共有，附图27和附表47-49)。我们发现494个OTUs在拟南芥与水稻、小麦相比特异（图4C/D）。其中34%(494个中的170个)下降（图4C和附表50-55），18%(494中的88)在突变体中上调。与拟南芥不同，水稻和小麦不能合成thalianin, TFAEs, 或arabidin（附图28）。以上结果表明拟南芥三萜可能为拟南芥富集1/3的特异菌（图4C），同时特异下调18%的细菌群体（图4D）。三萜突变体中存在大量的OTUs下降（总数为380个，图4C，粉圈），和富集的OTUs（298）相比，三萜合成网络主要富集拟南芥特异菌，而不是排斥其它细菌。
图4. 三萜通路的突变体特异调控的根系细菌类群
(A) 基于Bray-Curtis距离的有监督主坐标轴分析展示基因型对菌群调控的效应。
(B) 不同基因型门水平的根系微生物组成。其中Proteobacteria门由于丰度高于50%，进而划分为Alpha, Beta, Delta 和 Gemma四个纲进行展示。# 号表示Bacteroidetes与野生型Col-0存在显著差异（P < 0.05，Wilcoxon秩和检验）；
(C, D) 维恩图展示了的拟南芥三萜突变体中下调(C)或富集(D)的OTUs，与水稻和小麦与拟南芥野生型相比变化的OTUs大量重叠
纯化的三萜化合物选择性调控根系细菌
Purified triterpenes selectively modulate root bacteria
为检查是否三萜通路的代谢物直接调控 根系菌群成员，我们采用限制稀释法获得昌平农场土壤中种植的拟南芥根部细菌。选择了19个细菌分布于17个属，包括3个菌门Proteobacteria,
Actinobacteria和Firmicutes。这些菌种至少与突变体中差异OTUs相似度>97%（附图29，附表56）。这种菌在液体下培养，与化合物混合物共培养以研究其生长情况（附图30-34）。我们发现大多数变形菌在有化合物下生长更快，而对5种放线菌有抑制作用（图5A，附图30-34）。这些与菌株对应的OTUs（16/19)与菌株有受三萜生长促进或抑制效应存在相同的变化规律，表明这些化合物对根系细菌的选择活性（附图30-34）。此外，相应上升或下降的10个菌属（59%，共17个检验的属）在至少一个突变体中对代谢物敏感(附图35，附表57-63)。进一步研究菌株与纯化合物的调控关系，研究结构的不同对菌的影响。例如，我们发现Arthrobacter sp. strain A224可以被 T2, T9, T10, 和A5抑制，但其它化合物无效；Gammaproteobacteira Arenimonas sp. strain A388表现为受所有化合物的促进生长（图5B/C）。A475-1 (Agromyces sp.)具有乙醇脱氢酶活性，可以选择性的将T2代谢为3-keto-T2(图6A/B，附图37A)。菌株A215 (Pseudomonas sp.)有脂酶活性，可以剪切TFAEs T18a - T18c为T1和脂肪酸（图6C/D，附图S37B-D）。此外，strain A215可以使用剪切的产物] 棕榈酸作为碳源(图6E)。如此多样的根系代谢物和不同的根系微生物组成员，表明代谢物的生物合成网络改变了拟南芥根系微生物组装。基于以上扩增子测序和体外实验，得出结论为三萜生物合成网络调控拟南芥根系生态位中微生物组的组装和维持。
图5. 代谢物对根系细菌的效应和细菌介导的化学转换
Fig. 5. Effects of pathway metabolites on the growth of isolated A. thaliana root–associated bacteria and bacterium-mediated chemical transformations.
(A) 混合化合物对19个拟南芥根系细菌株的生成调节活性(混合物Mix包括10 mM T1, 5 mM T2, 20 mM T9, 20 mM T10, 10 mM T18a, 5 mM T18b, 1 mM
T18c和10 mM A5)。
热图展示添加混合物(Mix)后相比对照在48或72小时内的倍数变化取2为底的对数。相对应的生长曲线见附图30-34。
(B) Arenimonas sp. strain A388在0-72小时内对单种和混合化合物的响应。
(C) Arthrobacter sp. strain A224在0-48小时内对单种和混合化合物的响应。化合物溶于乙醇，对照为末加化合物的乙醇。
图6. 细菌介导的三萜转换
Fig. 6. Bacterium-mediated transformations of triterpenes.
（A）Agromyces sp. strain A475-1转换T2为3-keto-T2，基于（B）GC-MS代谢组分析比较细菌培养提取物。
（C）Pseudomonas sp. strain A215转化TFAEs T18a为T18c，基于（D）GC-MS代谢组分析比较细菌培养提取物。
（E）Pseudomonas sp. strain A215可以使用棕榈酸作为碳源。
结论
Conclusion
三萜合成网络有潜力合成超过50种根系代谢物（图2）。这对于拟南芥野生型根中己知代谢组中300种极性非挥发性代谢物，85种非极性的乙酸乙酯提取物是很高比例（附表64-65）。这个网络起源于基因簇的分化，并共用周围基因形成多个生物合成通路。根系代谢物可选择性调控不同分类学细菌的生长，可以作为抗生素或生长促进剂。根系特异表达的三萜调控很大比例(52%, 258/498个OTUs，图4C/D)的拟南芥特异细菌，以形成拟南芥特异的根系菌群。三萜是一大类多样的自然产物，迄今为止发现有2万多种，很可能塑植物的微生物组，产生植物特异的微生物组，可能应用于微生物工程和可持续农业。我们假设植物界的代谢多样性，为植物提供基本的交流、识别以塑造宿主所需的微生物群落成为可能，也部分解析了植物特异的代谢过程的意义。
材料方法
Materials and methods
微生物组分析
Microbiota analysis
拟南芥三萜突变体和野生型Col-0种植于昌平农场的自然土中（中国，北京，北纬40°5′49’’, 东京116°24’44’’）。两个小麦（Xiaoyan54和Jing411）和水稻（IR24和Nipponbare）分别于2016和2017年种植于昌平农场。拟南芥、水稻和小麦的根于种植后6周收样，并进行16S rRNA基因测序。数据分析采用QIIME 1.9.1，USEARCH 10.0和自编写脚本。差异分析采用edgeR包，基于负二项分布的广义线性模型，差异倍数的阈值为1.2。Venndiagram包用于绘制维恩图。
体外单菌互作实验
In vitro bioassays
细菌分离自拟南芥根，采用限制稀释法，并标签测序。19个与OTUs序列相似度>97%的菌株用于活体检定。这些细菌与三萜化合物或混合物共培养于TSB培养基中48-72小时。19种细菌鉴定介异的三萜转化实验，包括T1, T11, 和 T18a-c。T2, T9和T10与菌株A224, A475-1和 A479。
更多信息，请阅读原文：正文11页，在线补充材料113页。
附图
附图23. 多样性指数
Fig. S23 Shannon diversity index
附图24. 曼哈顿图展示三萜突变体对微生物组的调控作用
Fig. S24. Manhattan plots showing modulation of OTUs in the microbiota of triterpene mutants.
图中每个点代表一个OTU。突变体与野生型相比，显著富集或下调的OTUs分别用实心上三角和空心下三角表示(P < 0.05)。OTUs按物种注释排序，并按门和纲水平着色。CPM代表百万分比。
附图25. 突变体与野生型间差异的根系微生物组
Fig. S25. Root microbiota differences between the A. thaliana Col-0 wild type and the pathway mutants.
热图展示三萜通路突变体与野生型Col-0相比差异的OTUs。分别为thas-ko1 vs. Col-0 (A), thas-ko2 vs. Col-0 (B), thah-ko vs. Col-0 (C), thao-ko vs. Col-0 (D), thaa2-ko vs. Col-0 (E), thaa2-crispr vs. Col-0 (F)。突变体富集的OTUS在图中右侧标记为黄绿色，下降的标为蓝色。左侧色条为按门和纲水平着色。OTU相对丰度采用Z-score按行标准化。各组样本量Col-0 (n = 12), thas-ko1 (n = 12), thas-ko2 (n = 9), thah-ko (n = 14), thao-ko (n = 13), thaa2-ko (n = 9)和 thaa2-crispr (n = 12)。
附图26. 突变体中共上调和下调的OTUs在根与土壤相比的热图
Fig. S26. Taxonomical composition and enrichment of mutant co-enriched and co-depleted OTUs in A. thaliana roots vs. bulk soil.
热图展示突变体中共富集的OTUs（右侧绿色）和共下调的OTUs（右侧淡粉色）。这些OTUs绝大多数都显著在拟南芥根中富集，无土壤中特异富集的菌，表明三萜网络对植物根系细菌的选择活性。
附图27. 拟南芥、水稻和小麦种植土壤中OTUs数量比较
Fig. S27. Overlapping OTUs detected in unplanted soils used to grown A. thaliana Col-0, the triterpene mutants, rice and wheat
三种植物土壤共有OTUs比较，其中拟南芥土壤生物学重复为27个，水稻土壤为3个，小麦土体土壤为3个。
附图29. 选菌实验的合理性和步骤
Fig. S29. Rationale and procedure for selection of bacterial isolates for in vitro growth assay.
突变体与野生型间差异的OTUs；
细菌分离自昌平农场自然土中生长的拟南芥根系；
16S rRNA基因序列间相似度小于97%的菌用于实验；
共选择了19个不同的OTUs对应了19个不同的细菌，属于三个主要的野生型与突变体差异的门，包括变形菌门(5个Alpha，3个Beta，5个Gemma)，5个放线菌，1个厚壁菌门。
附图30. 拟南芥根系Alpha变形菌门对三萜混合物的响应
Fig. S30. Growth modulation activities of different formulated triterpene mixtures on A. thaliana root Alphaproteobacteria
不同OTUs在土壤、拟南芥Col-0和突变体中的丰度，以及其对混合物1、2和3的处理下的生长曲线。