直播精华｜施毅：新型冠状病毒肺炎核酸检测的意义、问题与对策——阻击新冠 权威在线（10）
首先在这里向战斗在武汉一线的各位同道们表示敬意，你们在前线为全国人民作出的贡献，你们辛苦了！一定要注意防护，注意自己的健康，你们的健康才是病人的健康！
今天想和大家探讨新型冠状病毒肺炎核酸检测的意义、问题与对策。实际上新型冠状病毒肺炎已经流行了将近两个月，大家已经非常辛苦，都希望能够尽早出现拐点，能够把整体形势向好的方向发展。即使这么短的时间，国家卫健委印发的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》已经第六版了，又专门在2月7号发文把名称进行更改，「新型冠状病毒感染的肺炎」改为「新型冠状病毒肺炎」，简称「新冠肺炎」。从呼吸科医生的角度来讲，现在的名称更为恰当，其他感染性病原体的肺炎也都是直接称为金葡菌肺炎、军团菌肺炎等，这样更符合临床。
如下图所示，这是截至2020年2月20日的疫情地图，中心就是湖北，也是颜色最深的地区。
新型冠状病毒肺炎疫情与诊断现状
2019年12月以来，湖北省武汉市部分医院陆续发现多例新型冠状病毒感染的肺炎患者，随着疫情的蔓延，我国所有省市自治区和港澳台地区及境外也相继发现此类病例。现已将该病纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并按甲类传染病管理。随着对疾病认识的深入和诊疗经验的积累，国家卫健委制定的《新型冠状病毒感染的肺炎的诊疗方案（试行第六版）》已经发行。但临床上新冠肺炎的诊断依然存在极大的问题，特别是确诊病例。
随着疫情的发展，武汉地区由于病人太多，而能进行核酸检测的实验室太少，许多标本不能及时得到检测，使疑似病人的确诊较为困难，导致疫情控制受到影响。其次，患者检测结果的阳性率不高，出现假阳性和假阴性，使病情判断更为困难。同时，大量病人等待检测，结果又没有预想的那么可靠，不得以武汉市有临床医生呼吁用胸部CT「代替」病毒核酸检测。这并不代表核酸检测不重要，而是在疫情严重情况下存在一些问题，会影响病情的判断，用胸部CT基本上判定为新冠肺炎有利于治疗，而不是胸部CT真的可以替代病毒核酸检测。并且，国家卫健委制定的《新型冠状病毒感染的肺炎的诊疗方案（试行第五版）》专门为湖北省制定了临床诊断病例，也希望改善不同地区诊断的现状。当然随着湖北地区核酸检测能力的大大加强，第六版又取消了临床诊断病例。
为什么会对确诊标准中的核酸检测提出疑问？
我将对以下四个方面进行探讨：新冠肺炎的疑似病例、临床诊断病例、确诊病例的诊断标准；核酸检测在新冠肺炎确诊中的价值与意义；核酸检测在临床实际应用中存在的问题（重点）；核酸检测的应对策略与发展方向。
一、新冠肺炎的诊断标准
国家卫健委《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》
从国家卫健委发布《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行）》第一版至今，已经是第六版。尤其近期频繁的更新，第四版（1月27日），第五版（2月4日），第五版修正版（2月8日），第六版（2月18日）。国家诊疗方案的不断更新提示临床诊断的困难，需要随着疫情的变化，根据临床经验不断总结修正。下面我们来探讨第五版、第六版指南的临床诊断。
（一）疑似病例
结合下述流行病学史和临床表现综合分析：1、流行病学史1）发病前14天内有武汉市及周边地区，或其他有病例报告社区的旅行史或居住史；2）发病14天内与新型冠状病毒感染者（核酸检测阳性者）有接触史；3）发病前14天内曾接触过来自武汉市及周边地区，或其他有病例报告社区的发热伴有呼吸道症状的患者；4）聚集性发病。
五版诊疗方案中流行病学的变迁
第一、二版，只是说有过武汉市华南海鲜市场暴露者，那时的病例数少，患病人群主要集中在40~60岁，没有发现儿童患者。第三版就有所改变了，把武汉市作为疫区，同时提出所有的人群都是易感人群，包括儿童。第四版，已经不止武汉地区，而且人群普遍易感，儿童也不例外。到了第五、六版，除了武汉，有更多的其他地区成为有持续病例报告的社区，在这里，只要与患者有接触，就是符合流行病学史了。
比较与解读-01
由此可见流行病学史最大的变化：
>变迁：改为武汉市及周边地区，或其他有病例报告社区：①旅行史或居住史；②接触发热伴有呼吸道症状的患者，变得越来越模糊。>强调：与新型冠状病毒感染者有接触史。新型冠状病毒感染者是指有病原核酸检测阳性者，无论来自哪里。>提示：来自非武汉和湖北者也可能是了，只要是患者。总体而言，流行病学史放宽了诊断标准。
（一）疑似病例（湖北以外省份）
2、临床表现发热和/或呼吸道症状；具有上述肺炎影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，或淋巴细胞计数减少。有流行病学史中的任何一条，符合临床表现中任意2条。无明确流行病学史的，符合临床表现中的3条。
（一）疑似病例（湖北省）
2、临床表现发热和/或呼吸道症状；发病早期白细胞总数正常或降低，或淋巴细胞计数减少。有流行病学史中的任何一条，或无明确流行病学史的，且同时符合临床表现中的2条。
比较与解读-02
第五版中临床表现最大的变化是把湖北以外省份和湖北进行了区分，湖北省疑似病例的诊断标准是大大放宽的。
>与以往的临床表现相比，增加了和/或呼吸道症状。>疑似病例诊断标准（湖北以外省份）中改变最突出的是：①临床表现中的三点都必须具备，改为「符合临床表现中任意2条」，对应「无肺炎表现」患者；②但无明确流行病学史，3条都必须具备。>新增疑似病例诊断标准（湖北省）：①临床表现只有2条，且没有肺炎的要求；②无论有无明确流行病学史，2条都必须具备。>提示：①流行病学史放宽，不是必备；②湖北以外不一定要有肺炎表现，防止漏诊；③湖北省可以不考虑肺炎。
（二）临床诊断病例（湖北省专用）
为了进一步帮助湖北省的诊断，单独为湖北省增加了临床诊断病例，也就是疑似病例具有肺炎影像学特征者。
比较与解读-03
专门为湖北省设定「临床诊断病例」的诊断标准。在湖北地区大疫情的特殊状况下，由于核酸检测困难或难以及时进行，很多非常符合确诊的病人得不到诊断，反而造成感染源控制不好，导致传播扩散。以至于武汉一线的医生不得不提出以CT代替核酸检测的呼声；增加临床诊断病例，可以缓解这一困境。
当然，随着湖北核酸检测能力的改善，第六版诊疗方案，又取消了湖北以外省份和湖北省的区分。
（三）确诊病例
疑似病例，具备以下病原学证具之一者：1. 呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；2. 呼吸道标本或血液标本病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。
比较与解读-04
确诊病例的诊断标准与以前没有太大的改变。分子生物检测是确诊病例的实验室检查标准。确诊方法中，标本来源增加了血液标本。提示病毒感染容易入血，出现病毒血症，增加血液标本可以提高检出率。在没有或难以获得呼吸道分泌物的患者，可以采集血液标本送检，检测的方法有两种，实时荧光定量PCR（RT-PCR）和病毒的基因测序。
第六版进一步做了修改，核酸检测不再强调检测的标本，只要新冠病毒检测阳性，就可以作为确诊病例了。
（四）影像学检查
主要强调一下影像学检查，因为之所以质疑核酸检测其中一条就是认为影像学检查非常重要，可以替代核酸检测。从诊疗方案中可以看到影像学改变主要表现为早期呈现多发小斑片影及间质改变，以肺外带明显。进而发展为双肺多发磨玻璃影、浸润影，严重者可出现肺实变，胸腔积液少见。
诊疗标准不可能说得非常详细，很快中华医学会放射学分会专门发布了一个专家推荐意见，其中特别强调影像学检查对于诊断是非常重要的，特别是有无肺炎的改变，因为肺炎的患者还是占了多数。
截图来源于公众号「呼吸之翼」
新冠肺炎的放射学诊断中华医学会放射学分会专家推荐意见
胸部Χ线平片（图2-4）：
早期普通型患者就是小斑片的磨玻璃影，重症患者可以看到两肺弥漫，危重症患者出现两肺白肺的改变。
胸部CT片（早期，图5-8）：
毫无疑问，CT检查更重要，一再推荐有条件尽量做CT检查。早期有单发或多发的局限性磨玻璃阴影，所以不一定是双侧，早期可能是单侧，但很快进展到多发。
胸部CT片（早期，图9-12）：
胸部CT片（早期，图13-15）：
胸部CT片（进展期，图16-20）：
胸部CT片（重症期，图21）：
二、核酸检测对确诊的意义与价值
了解了这些诊断标准后，我们来看看核酸检测对确诊的意义到底有多大。
（一）CAP何时应该进行病原学检测
新型冠状病毒肺炎实际上就是CAP的一种，CAP里面包括细菌、病毒、非典型病原体，那么CAP患者何时和应该采集哪些标本进行哪些实验室检查？《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）》有明确规定，通常情况下，门诊患者不需要进行病原学检查，但特定情况下和住院患者，应该进行相关的实验室检查。指南中有非常明确的CAP特定临床情况下建议进行的病原学检查，需要进行呼吸道病毒筛查有五种情况：群聚性发病、初始经验性治疗无效、重症CAP、双肺多叶病灶和免疫缺陷的患者。
（二）病毒学检查方法
临床高度怀疑病毒性肺炎时，应考虑进行相关的病毒学检测。目前推荐的检测共四种，包括病毒分离培养、血清特异性抗体检测、病毒抗原检测和核酸检测。病毒分离培养非常困难，在临床上一般都不用病毒分离培养作为临床诊断的标准，一般只有在实验室进行研究时才进行的病毒分离培养。血清特异性抗体检测通常要有恢复期血清，对现症的诊断价值不大。所以实际在临床应用的诊断病毒性肺炎的指标主要有两个，一个是病毒抗原检测方法，包括直接免疫荧光法（DFA）和胶体金法检测，使用胶体金法比较多，虽然胶体金法特异性比较好，但是敏感性并不高；另一个是核酸检测。在甲流诊断中，实际临床应用的主要方法是病毒抗原检测（如胶体金法检测）和核酸检测。所以实际上在临床上核酸检测还是非常重要的。
《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）》推荐的病毒学检测方法
（三）新型冠状病毒检查方法
首先在所有六版诊疗方案里，毫无疑问都把核酸检测作为确诊病例的实验室诊断标准，只是从早期的呼吸道标准，扩展为呼吸道与血液标本，阳性指的是在鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、粪便等标本中可检测出新型冠状病毒核酸。到第六版已经不再考虑标本来源，只要核酸检测阳性即可确诊。方法为：①实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；②病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。
核酸检测是不可替代的确诊方法：对合理应用有限的医疗资源，及时救治病人非常重要，不能或缺
第一，病原抗体检测有窗口期，要在后期才能出现抗体，往往滞后于核酸检测。第二，核酸检测的敏感性要远远高于刚才提到的其他实验室检测方法。第三，核酸检测阳性要比胸部CT出现改变更早，我们现在知道已经有无肺炎表现的患者，所以它显得更加重要。第四，有核酸定量检测，这种定量检测可以动态监测病毒感染的程度，观察治疗效果。
（四）目前应用的实时定量PCR检测试剂盒
现在已经有很多应用在临床的实时定量PCR检测试剂盒了，这是其中一种。
（五）新型冠状病毒PCR检测方法
PCR检测方法实际上是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，对起始模板进行定量分析的方法。
实时定量PCR技术定义与原理
大家都非常熟悉PCR方法，就是核酸体外扩增的过程，一个循环包括变性-退火-延伸三个步骤。所谓实时是每一个PCR循环都对荧光信号进行实时监测，而荧光是每合成一个DNA分子即有一个荧光信号产生。因此我们就可以做定量分析，即模板的初始浓度的对数值与其Ct值成线性关系 lg X0= -lg(1+Ex) *Ct+lgM，就可以从Ct值来判定核酸载量的多少。
实时定量PCR技术的常用名词
扩增曲线：收集每一个循环的荧光读数绘制扩增曲线；
新型冠状病毒实时荧光PCR检测方法
Real-timePCR：在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。是目前2019-nCoV核酸检测主流方法，成本较低，操作简便，需要硬件PCR实验室，PCR仪等。新型冠状病毒实时RT-PCR检测流程
大家一定要注意，PCR方法虽然非常敏感，但是实际针对某一病原阳性检出率为30%-50%，超过50%诊断依赖临床诊断病例，包括NCP（新冠肺炎）诊断。
（六）新型冠状病毒的基因测序
这段时间大家也比较熟悉基因测序，NGS的广泛应用已经使大家对病原学基因测序非常了解。基因测序是通过对标本的基因测序，与已知的2019-nCoV高度同源。这个方法非常准确，用于争议样本的最终确认，监测病毒的变异，病毒的溯源等，但是成本较高，操作较复杂，需要测序仪和专业的生信分析等。
基因测序的好处有哪些？第一，与PCR相比，因为病毒在传播过程中可能发生变异，这时候PCR就检测不出来了，但是高深度宏基因组测序（测序总reads数不低于80M DNA序列）可以弥补RT-PCR的缺点，并监测可能的变异；第二，部分病毒含量较低的样本，低于RT-PCR最低检出限，而人源宿主背景较低时，宏基因组测序可以有效提高检测阳性率；第三，对于冠状病毒检测阴性的疑似感染，宏基因组测序能够有效提供其他可能感染病原信息；第四，宏基因组测序还能够提供多重感染或继发感染相关病原信息。
所以如果结合RT-PCR和宏基因组检测，可更快、更全面覆盖2019-nCoV病毒检测，并监测新型冠状病毒在传播过程中可能会发生的变异。
三、核酸检测在临床实际应用中存在的问题
（一）目前病毒核酸检测方法的困惑
现状：
①前段时间王辰院士在中央电视台采访时提出，确诊患者中咽拭子的阳性率仅为30%-50%。实际的阳性率有多高，还需要我们进一步探索。②临床已发现CT为肺炎，又有明确流行病学史，但核酸检测阴性者。这是假阴性吗？③由于检测机构少，检测速度远远赶不上临床需要，很多患者因为等待检测而延误诊断和治疗。短时间能解决吗？④临床判断已经觉得非常不像新冠肺炎，但核酸检测却是阳性。会是假阳性吗？因此，核酸检测虽然很重要，能够推动病例确诊，合理应用有限的医疗资源，及时救治病人，不能或缺，但是这些问题会干扰临床诊断。
（二）目前病毒核酸检测方法的问题
问题：
①为什么检测的阳性率这么低？是我们的检测试剂不行吗？②临床非常符合诊断标准的病例，为什么检测不出来？③既然检测机构少，为什么不能多开放一些医院进行核酸检测？④为什么会出现假阳性？⑤既然检测不可靠，为何不能用胸部CT来替代核酸检测？这就是临床提出的越来越多问题，我总体感觉，对于核酸检测存在的问题，我们不能一棍子打死，应该仔细分析原因，改善检测结果。
假阴性原因
总体而言，最大的问题就是假阴性。对于假阳性来说，至少把病人隔离，不让疾病传播，那么假阴性的话，就会把可能确诊的病人放出去，造成更大的传播，这个问题更严重。
初步归纳假阴性的原因可能与疾病本身特点有关，与咽拭子采样的局限性有关，与运输、保存等问题有关，与PCR试剂盒的缺陷有关。
（三）目前病毒核酸检测问题发生的原因
原因1：标本采集的时机与部位不对导致的误差。
病毒感染在不同阶段所影响的器官的深度是不一样的。早期病毒分布在上呼吸道，随着病情发展，上呼吸道病毒被清除，而下呼吸道病毒载量反而升高，因此应该尽量同时采集下呼吸道标本（深部痰液，BALF）。BALF最好，但难以获得，传播风险高，比较耗时，所以并非所有病人需要，也并非适合。重症患者深部痰不易咳出。因此，鼻、咽拭子最常用，但与病程密切相关，目前的最佳采样时机尚不清楚。按甲流24-72h到高峰，然后迅速下降，那么新冠病毒有没有可能也是这样，到后期是不是就不容易从鼻、咽拭子检出了。另外，采样的问题与人为因素也有关系，一线采样人员有巨大的感染压力，可能导致采样不彻底不完全而导致假阴性。此外，采样的手势和拭子的材质质量对样本质量也是至关重要的。
原因2：标本运输限制：采样后样本的保存和运输会影响结果。
RNA病毒之所以和DNA病毒不同，DNA病毒不太容易变异，但是RNA病毒就特别容易变异，也容易降解。在采集过程中，RNA病毒的核酸由于自降解和生物酶介导的降解，是最难以稳定保存的生物分子之一。因此，含有RNA病毒的样本建议存放于专用的病毒保存液中，且必须在冷藏（即4度或更低温度）状态下保存并尽快运输送检。新冠病毒的储存和运输要求可能更高。而现状是，大多数医院采集后需要集中送至CDC中心统一检测，从采样到实际开展检测可能经过长时间的等待，影响检测质量。同时开展检测的实验室是否具备专业能力也是影响因素。
原因3：试剂盒问题。
出现核酸检测的标准后，很多公司开发PCR试剂盒，而且开发PCR试剂盒并不困难。国家FDA在全国53家能够生产试剂盒的公司初步筛选出7家公司，通过应急审批流程，于1月26日最初认定4家公司生产的试剂盒正式作为检测试剂盒在临床应用，分别为华大基因新型冠状病毒检测试剂盒、华大智造DNBSEQ-T7测序系统、上海捷诺新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（RT－PCR法）和上海之江新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（RT－PCR法），可供大家参考。后又增加3家，但是全国有50多家生产试剂盒的公司，一家公司只能供应一部分医院，很多医院用的其实是那些没有批准的试剂盒。所以大量试剂应急上市，不可避免地因产品质量问题和过度宣传等原因引发了一些负面评价。甚至出现了据称能十几分钟检测出结果，敏感度和特异度达到100%的过度宣传。此外，应急审批，最终还是需要按照法规要求补充完成所有的临床验证才能延续注册，从而用于常规临床诊断。
原因4：大样本研究及临床验证的缺失。
这种试剂盒真的能完全准确的检测吗？这本身需要在临床应用中去检测试剂盒的可靠性。大多数新冠病毒检测试剂都是靶向新型冠状病毒的特定区域，通过RT-PCR扩增病毒的ORF1ab基因和N基因等进行荧光定量检测。然而，新冠病毒属于RNA病毒，很不稳定，容易产生变异，现在针对该病毒的研究刚刚开始，病毒基因的变异频度如何，是否存在突变热点或进化上的保守区域都尚未可知。现在的试剂只能根据有限的公开数据进行引物设计，但对大样本中的实际情况缺乏了解，只能在临床一线用了再说。很难排除个别样本由于扩增区突变导致假阴性的可能。
原因5：试剂缺乏监控核酸提取质量的内标以及样本间、样本内重复。
目前的检测试剂盒大多数仅针对核酸提取后的检测，而对于RNA提取的方法以及质量未做明确的说明，从而导致不同方法学提取的RNA质量良莠不齐，从而影响最终的扩增效果。同时，缺乏样本间、样本内的重复，也可能造成假阴性。
四、检测核酸检测的应对策略与发展方向
（一）规范标本采集方法
尽可能采集下呼吸道标本，特别是BALF标本或深部痰，阳性率更高。掌握采集标本的时机，早期鼻咽拭子为主，晚期BALF为主。这并不代表鼻咽拭子后期检测不到，我们有两个病例，确诊三四天，住院已经超过12天，在这期间间断的进行核酸检测，一直到第12天仍是阳性。规范鼻咽拭子、咽拭子的操作程序；同时做好采集人员的防护（医用N95口罩、护目镜、手套、防护面罩、防护服等）。采用合格的（高质量的材质）鼻咽拭子和咽拭子 规范实验室检测的操作流程，保证实验结果的可靠性和正确的解读结果。标本及时送检。
我们再来看看采集的方法
比较好的拭子相当贵，不像我们平常拿一个长棉签就可以采集。可以经咽部采集，也可以经鼻腔采集。如果要经鼻咽部采集，拭子一定要伸到鼻咽部，大部分采集的时候都只在鼻孔这片区域采集，这样阳性率也不一定高。所以鼻咽拭子的采集方法非常重要，大家一定要关注。
（二）改进标本的运送
及时采集标本，及时送检标本。降低RNA病毒的核酸的降解，样本存放于专用的病毒保存液中，在冷藏（即4度或更低温度）状态下保存并尽快运输送检。加快检测速度，减少标本等待检测的时间。在具备专业能力的实验室进行检测。
（三）改进试剂盒的审批
加快审批试剂生产可靠的厂家的数量和质量，国家卫健委通过应急审批流程认定了7家公司生产的试剂盒正式作为检测试剂盒在临床应用。同时要加快定点医院2P加强实验室的建设，让更多的医院能够及时进行检测。关注检测实验室的生物安全性问题。保证检测试剂的质量，需要所有生产厂家按照法规要求补充完成所有的临床验证才能延续注册，从而用于常规临床诊断。
1月26日首批应急审批4家：
不同厂家试剂盒性能存在差别，分析原因如下：
1. 引物探针系统的特异性与效率：需要良好的参考序列和生信分析能力，选择合适的靶标区域；2. 工艺体系的稳定性：需要丰富的体外诊断试剂开发能力，建立稳定高效的工艺体系。我们希望去选择具有更高的灵敏度、更可靠的试剂盒来提高检出率和可靠性。
选择通过临床真实阳性样本验证，性能稳定，取得NMPA注册证的试剂，产品质量有保证。
（四）改善检测技术
采用标准的病毒特定检测区域。2019-nCoV为线性单链RNA（ssRNA）病毒，基因组全长约29903个核苷酸，共包含10个基因，具体位置和功能见下图：（ORF：开放阅读框（Open reading frame）是指在给定的阅读框架中，不包含终止密码子的一串序列。这段序列是生物个体的基因组中，可能作为蛋白质编码序列的部分）
经过对新型冠状病毒全基因组序列分析，卫健委推荐病毒的三个基因区域（ORF1ab、E、N）可以作为PCR检测的靶序列进行引物探针设计。
冠状病毒是一大类病毒，包括SARS、MERS及其他引起普通感冒的冠状病毒。E基因和N基因在冠状病毒内相对保守，尤其与229E/OC43/HKU-1等感染人但传播能力较差的冠状病毒存在交叉，以上病毒在自然循环中本身存在，因此用于做靶序列检测时会导致其他冠状病毒阳性。
要避免靶序列带来的交叉污染需要良好的参考序列和强大的生信分析能力找到新型冠状病毒的特异区域设计适合的引物探针。研究显示新型冠状病毒的特异区域主要集中在ORF1ab基因和S基因。
对于病原检测，并不是越多基因越好。实际上，引物探针之间会互相干扰，导致灵敏度降低，其中二重会弱于单重，三重会低于二重！比如HIV检测试剂盒，靶序列有gag、env基因等，只对其中一个靶序列进行检测，已达到了极高的灵敏度和准确性。
（五）综合评估（回归临床）
最后还是要强调，拿到核酸检测结果后一定要回归临床。加快生产试剂盒，拿到质量好的试剂盒，加强实验室建设，同时规范临床、特别是基层医院和卫生服务中心正确地采集临床标本，规范实验室检测的操作流程，保证实验结果的可靠性和正确的解读结果。再和临床表现、流行病学史相结合以后进行综合评估，不要单独以阳性、阴性做决定。
总结
对实验室检查改进方面，强调以下五点：
第一，必须掌握新型冠状病毒肺炎的诊断标准；第二，一定要正确采集标本，正确运送；第三，检测结果不一致者，增加检测次数，难以判定时，可以送第三方检测机构进行测序确认；第四，采用合格的检测试剂盒，是国家卫健委审批的或者是国家CDC推荐的；第五，结合临床实际正确的解读检测结果。
五、结语
正确的检测方法需要从源头抓起，首先是控制取样的质量，其次是严格保存和运输条件，采用可靠的检测试剂盒，规范检测的操作流程，然后再将检测结果和临床情况相结合，最终对结果做出合理的判断和解读，一定要有这个概念。胸部CT和核酸检测是同样重要的诊断技术，需要联合应用，才能在新冠肺炎的诊治当中发挥巨大作用。
答疑与讨论
王一民：正面来看，就像您刚才举例子，有些阴性的病人最终确诊是通过下呼吸道标本确诊的，但是反过来，同样采取两次阴性的方法让病人出院。很多网友询问，这时的阴性结果可信吗？您怎么看待？我们医院现在的做法是如果病人真的是高度疑似病例，我们建议病人至少留观到临床表现好转或者影像学吸收，哪怕他是阴性，我们也不敢完全放走，不知道您那边采取什么样的方法？
施毅：我特别赞同您所说的方法。我刚才讲到我们医院的两个病例，其实这两例在入院之前已经在院外有四五天的时间了，第一次核酸检测结果为阳性就收入院，现在已经住院12天。从住院的第1天到现在12天，我们连续监测的这两例一直为阳性，再加上院外住已经有四五天，也就是说超过两周都是阳性。而这两例还不是重症病人，都是轻症病人，症状早就没有了。最近复查了胸部CT，一例病人的影像学已经完全恢复，只剩一些纤维条索影，另外一例病变明显吸收，还有病灶，但是这两例咽拭子检测依然为阳性。因此，病人哪怕症状明显缓解，也不代表他已经反应，时间可能会更长。如果两次转阴，是不是就能出院，其实在临床实践过程中，我和您的体会是一样的，我们真的不敢完全让病人出院。所以我完全同意您的观点，两次转阴以后，如果还有临床症状，如果影像学还没有完全吸收，也再观察一段时间，再做1~2次的核酸检测。如果临床症状和CT完全吸收，核酸检测阴性，再让病人出院。所以在临床实际操作过程中，大家可能要比诊疗方案把握得更严一些。
王一民：您刚才提到，在诊断的时候，如果遇到一些所谓的阴性，可能是因为标本的原因造成的，所以我们甚至可能多种的标本、多次的标本、不同的标本都会去送检。在不同的方法当中，现在诊疗方案推荐的方法其实都是分子生物学，一种是RT-PCR，另一种是NGS，在这两种方法中，如何衡量？比如什么情况下我们会送检NGS？
施毅：我觉得这个问题非常好。我更推崇PCR方法，因为它操作便捷、速度快、成本较低，更适合于大批量病人的检测。而NGS花费高、时间长，对于大批量检测来说，比较难以承受。所以作为普查，我还是赞成用PCR方法。但是，如果病人在检测过程中遇到问题，比如一会阳性，一会阴性，那么这个时候我觉得应该要介入基因测序；如果病人临床症状特别像，检测结果转阴了或测不出来，是不是有基因发生了变异，我们现有的PCR试剂盒检测不出来，就应该使用NGS。另外，如果是重症病人，怀疑同时有混合感染，他很有可能不仅是有新冠病毒，同时有其他病毒甚至其他细菌感染存在，特别是病人如果存在免疫功能低下，比如糖尿病、使用免疫制剂的人群，我建议这样的病人可能同时需要做NGS。这样来把控，就不至于让所有病人都去做NGS，又可以掌握一定的尺度，因为NGS还是比PCR方法有更多的优点。
王一民：好的，谢谢您。虽然目前国家没有推荐用抗原或者抗体检测方法，但是我们相信肯定陆陆续续会有类似的试剂盒生产出来，您如何评价试剂盒的临床价值？
施毅：我刚才提到病毒检测有四种方法，我们已经应用了核酸检测，病毒的分离培养在临床实际上是不可行的。那么就是另外两种方法，一个是抗体检测，现在很多其他的常见病毒也在做抗体检测，如果有试剂盒出来，对我们判定病人的回顾性诊断或者是PCR没检测出来，但是又高度怀疑的，抗体检测可以帮助我们判断。抗体检测还可以评估恢复期病人是否有充分的抗体存在，就可以采集恢复期病人的血清，给重症患者治疗。但是我个人更看重抗原检测的试剂盒，特别是胶体金方法。既然流感病毒能做胶体金方法，那新冠病毒为什么不能？我觉得方法学并没有太大的差异，只要能找到肯定的抗原点，作出可靠的试剂盒。在《流行性感冒诊疗方案》中反复修改胶体金方法，因为它的敏感性太低，但特异性还是很好的。如果我们按照这个方法检测，可能会漏掉一些病人，但它的特异性并不差，速度快。如果与核酸检测方法同时去做，其实还是可以给临床提供很大的帮助。
王一民：核酸检测与病人的病情有没有关系？一些报道提到，如果病人的病情越重，相对来说能检测到的阳性率可能越高；病人症状较轻，可能相对来说检测的阳性率会略低，您怎么看待这件事？
施毅：我个人认为核酸检测阳性率的高低与病人病情的轻重不存在直接关系。而是因为病情严重，更容易采集到下呼吸道标本，所以阳性率高。而轻症病人，大部分是用鼻咽拭子，实际上临床的鼻咽拭子采集存在很多问题，受到影响因素多而更容易出现阳性率低的现象。我觉得这个因素可能会比与病情轻重关系更密切。其次，我们希望做出好的试剂盒，就是不仅要做出阳性和阴性，更希望做出定量。如果在定量里面去做，Ct值非常低，也就是病毒的载量非常高，对我们判定也有帮助，因为病毒载量越高就提示可能今后病情恶化的程度越大。所以我觉得如果能做定量PCR可能对病情的判断以及治疗你效果的判断都会更好。
王一民：谢谢施教授。有些问题可能与您今天讲的内容不是特别相符，但是很多网友还是想询问，这次的新冠肺炎仍然有很大的比例在使用抗菌药物。大家非常关心这样的问题，这也是一个非常经典的话题。明明是病毒性肺炎，为什么还要使用抗菌药物？您怎么看待？
施毅：每年病毒感染如何合理使用抗菌药物总是一个热门话题。其实这次有关新冠肺炎的WHO指南和中国的指南是不完全一样的。中国指南写的比较简单，因为它更多的是想去指导抗病毒治疗，对于合并继发细菌感染的内容比较简单，不要随意使用抗菌药物，同时不要随意运用广谱抗菌药物，只是强调了这一点，并没有说如何合理的运用。实际在临床中，大部分病人又在用抗菌药物，首先要鉴别诊断，刚开始不知道病人是否为病毒感染，有可能是细菌或支原体感染；其次，如果后期继发细菌感染，怎样去合理应用抗菌药物。这是两方面的问题，我还是非常赞成中国的指南，这个方案实际上是强调肯定会用抗菌药物，所以不再过多的说明如何使用，但是一定不要随意使用，不要过度使用。
但我觉得WHO指南讲的更实际一些，其中提到如果是轻症病人，非常明确不像细菌感染，尽量不要用抗菌药；但如果不能排除细菌感染，建议使用一般的抗菌药，不要用广谱抗菌药，这时根据病情的轻重来判定，轻症病人就这样去掌握，根据当地的流行病学和细菌耐药的状况来选择，经验性治疗首选一般的抗菌药物。但对于重症病人有不同的观点，因为重症病人病情非常重，开始并不知道会严重到什么程度，病毒会不会变异，进展会不会很快，因此建议对于重症病例，在尽快采集标本后广覆盖，然后再根据病原学检测的结果，进行降阶梯、更换相对敏感的抗菌药物或者是停用。我觉得这种方式可能对临床实际的指导意义会更大，虽然也没有讲的非常详细，因为毕竟是一个病毒性肺炎的指南，但是这会让临床一线的医生更容易掌握，否则只说要严控，没有具体措施，那就完全看个人的经验了。一般的医生就会很难掌握，现在已经牵涉到妇产科、儿科等医生在一线，这种情况下对一般的非感染科医生的指导意义会更多。
王一民：其实我在想不管如何推荐，新冠肺炎也是社区获得性肺炎，依然要围绕着我国在2016年发布的《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》给我们的一些建议。在明确是新冠肺炎的时候，可以根据病情分级，在经验性推断的时候，毕竟在南京、北京、上海等部分城市，新冠肺炎仍然是偏少数的病例。在其他的肺炎仍然存在的情况下，经验性使用抗菌药物也不能说是错误的，只要是围绕指南，采取不越位又不过分的措施，我觉得应该是可以的。感谢施教授做客我们的直播间，您能不能再用简短的话总结一下今天讲解的精髓，谢谢。
施毅：好的，我个人认为在新冠肺炎诊治过程中，首先，大家不要偏重于只有CT检查有用，只有核酸检测有用。其实在临床医生诊断的过程中，所有的措施对你做判断都是有帮助的，只是如何合理的选择检查方式，如何合理的评估这些检测指标。其次，核酸检测过程中确实存在问题，我们要知道它的问题，在尽量去纠正这些问题，比如如何正确采取标本，怎样保存和运输运送，怎样采用合格的试剂来检测。一定要记住，临床医生一定要把检测结果再回过头来和临床实际去结合判定，不要以一个指标来判定对与错，综合评估永远是临床医生的精髓，谢谢！
参考文献 （可上下滑动浏览）
[1]《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第五版 修正版）》
[2]中华医学会肺部学分会《中国成人社区获得性诊断与治疗指南）（2016年版）》[3]莫茜，秦炜，傅启华，等. 正确认识新冠病毒核酸检测的影响因素，中华检验医学杂志》，2020,43（00）：E002-E002[4]中华医学会检验学分会采样视频：https://mp.weixin.qq.com/s/pPuA6U-wGVLUoJoZk3pk0w12
专家介绍 - 施毅
南京大学附属金陵医院 呼吸与危重症医学科，教授、主任医师、博士生导师、博士后导师，美国胸科医师学会资深会员，中国医师协会呼吸医师分会常委兼呼吸系感染工作委员会副主任委员，中华医学会呼吸病学分会感染学组副组长，江苏省医学会呼吸病学会第七、八届主任委员，中国医药教育学会感染疾病专业委员会常委，海峡两岸医药卫生交流协会呼吸病学专业委员会常委，中国老年医学会呼吸病学分会常委兼感染学术委员会主任委员。
感谢东阳光对本次直播的大力支持！
感谢赛诺菲巴斯德对本次直播的大力支持！本文完
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本文由《呼吸界》编辑 大奔 整理、Jerry 排版，感谢施毅教授的审阅修改！
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