Erenumab之发现：首个GPCR抗体药物的开发
GPCR作为重要的药物靶点，却一度成为抗体药物的禁区。由于GPCR为七次跨膜蛋白，结构稳定性高度依赖于脂质双分子层，难于获得可溶的、结构精确的游离抗原。膜联形式的GPCR虽然可以作为抗原，但其抗原性却往往不如人意，无法获得足够的抗体用于后续筛选。
▲CGRP与偏头痛
2018年5月17日，FDA批准安进的CGRP抗体Erenumab，商品名为Aimovig，用于成人偏头痛的预防治疗。Erenumab由此成为首个获批上市的GPCR抗体，成为抗体药物发展史上的里程碑事件。2019年8月，安进神经科学总监、Erenumab的主要发明人徐岑博士在《ACS Pharmacology & Translational Science》上发表文章，介绍了Erenumab的发现过程。
▲安进神经科学总监 徐岑博士
CGRP受体抗体的设计标准
CGRP-R是由两个结构域组成的异源二聚体：降钙素受体样受体（CLR）和受体活性修饰蛋白1（RAMP1）。CGRP-R与肾上腺髓质素（AM）受体、淀粉纤维素（AMY）受体高度相关。三者的结构域类似，如AM1受体由CLR+RAMP1组成，AM2受体由CLR+RAMP3组成，AMY受体则由CTR+RAMP1组成。参与偏头痛发病机制的只有CGRP受体，而无AM受体、AMY受体。
▲CGRP受体与AM受体、AMY受体的对比
CGRP的C端与CLR-RAMP1胞外区（ECD）末端高亲和力相互结合，CGRP的N端则通过与CLR异源二聚体跨膜α螺旋相互作用发挥激动剂效应。根据上述特征，CGRP受体抗体的筛选应注意挑选结合表位同时涵盖CLR与RAMP1结构域，这样可以避免与AM受体、AMY受体的非特异性相互作用。
▲CGRP与CGRP受体的结合位点
需要注意的是，CGRP与CGRP受体的亲和力在15pM左右，意味着筛选的CGRP受体抗体与CGRP受体的亲和力至少也在pM级别。因此，CGRP受体抗原的筛选应注意表位的设计，以提高特异性，并通过大规模筛选获得足够高亲和力的抗体侯选物。
基于表位的抗原设计
针对前述考虑，徐岑等设计的全新抗原：共表达CLR的胞外区（ECD）和RAMP1的胞外区（ECD），分别将两者融合到用于稳定结构的Fc上，Fc与ECD之间有Linker存在以保证ECD无空间位阻限制，可以自发形成正确的空间构象。这一步类似于双特异性抗体的表达，随后纯化中根据分子量大小可以分离异源二聚体（下图B中的peak 2）。表达纯化后通过重组抗原对于CGRP与高表达CGRP受体细胞系的结合，证明CGRPR-ECD-Fc可以与CGRP受体竞争性地结合CGRP，表明抗原设计有效。
在抗体筛选过程，同时使用该新抗原与膜联CGRP受体作为免疫原免疫转基因小鼠，以进行全人源抗体的筛选。
抗体发现过程
抗体筛选使用的是原Abgenix的XenoMouse转基因小鼠。2006年安进以22亿美元的价格收购了Abgenix，拥有了自己的全人源抗体发现技术平台。该平台先后获批了6款全人源抗体：RANK抗体Prolia/Xgeva、PCSK9抗体药物Repatha、IL-17受体抗体药物Siliq、PD-L1抗体Imfinzi、CGRP抗体Aimovig等。
筛选过程：
CGRP-R高表达细胞用于筛选抗体与CGRP-R的结合：
反向筛选去除与AM受体结合的抗体；
建立CGRP信号通路主要二级信使cAMP检测的细胞学方法，以对1nM诱导cAMP产生的抑制率为评价标准。
使用CGRPR-ECD-Fc抗原免疫XenoMouse，产生10万个可以结合CGRP-R的单克隆，反向筛选后还有1092个克隆可以特异性结合CGRP受体而不结合AM受体，其中28%的克隆对cAMP的抑制超过50%。
使用膜联CGRP-R作为抗原，筛选效率则远低于CGRPR-ECD-Fc。10万个结合CGRPR的克隆中，仅有119个特异性结合CGRP受体。119个克隆中仅有2.5%对cAMP的抑制超过50%。
筛选结果再次说明基于CGRP受体独特表位设计的新抗原，对于筛选特异性的CGRP受体抗体至关重要。
接下来，对于cAMP抑制超过70%的167个克隆（绝大部分来自于新抗原组），检测其与AM受体和AMY受体的结合，大部分克隆均不结合，说明对CGRP受体的特异性较好。
通过对单克隆上清的高通量筛选，结果4个具有代表性的、序列独特性的单抗，与CGRP受体的亲和力均在pM级别，cAMP检测的IC50均在1.2-1.8nM级别，对其他受体AM受体、AMY受体则无效应。
最后，作者对抗体结合CGRP受体同时依赖于CLR、RAMP1异源二聚体的推论进行了进一步的验证。先用AspN蛋白酶切CGRPR-ECD-Fc，做肽图，然后再由CGRP-R抗体存在情况下切CGRPR-ECD-Fc。通过质谱分析比较肽图的变化，确定CGRP-R抗体的结合位点。
结果发现位于CLR的C5、C6、C7等肽段，位于RAMP1的R1、R2等肽段明显减少，说明抗体结合表位同时包括CLR和RAMP1结构域，也证实抗原设计的思路达到了预期效果。
小编总结
2018年Aimovig的销售额为1.19亿美元，2019年上半年销售额为1.42亿美元。Aimovig开启了GPCR抗体的新时代，同时从安进回国的景书谦博士创办了鸿运华宁生物，同样从安进回国的严海博士创办了科信美德生物，国内在GPCR抗体领域也有了一席之地。鸿运华宁的GLP-1受体抗体/GLP-1融合蛋白，科信美德的胰高血糖素抗体REMD-477都处于临床研究阶段。
我们也可以看到，安进这种国际领先的生物技术公司，在转基因鼠、抗原设计、抗体评估、表位设计与分析等方面的综合实力。在追赶一流生物技术公司的过程中，国内企业还有很长的路要走。
参考资料
Discovery of the Migraine Prevention Therapeutic Aimovig (Erenumab), the First FDA-Approved Antibody against a G-Protein-Coupled Receptor(2019)；
Cryo-EM Structure of the Active, Gs-Protein（2018）；
CGRP and its receptors provide new insights into migraine pathophysiology(2010)；
Development of Disulfide Peptide Mapping and Determination of Disulfide Structure of Recombinant Human Osteoprotegerin Chimera Produced in Escherichia Coli(2000)；
CN200980157606-人CGRP受体结合蛋白。
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