Nature突破！方晓峰博士等发现相分离在RNA 3’末端加工过程中的重要作用
在过去十年中，科学家们发现细胞中参与很多重要生物学过程的亚细胞结构如核仁、Cajal bodies、nuclear bodies等是由蛋白质、核酸以及其它生物大分子通过液-液相分离形成的聚集体【1, 2】。然而，目前对液-液相分离的研究主要基于体外实验，而对它在细胞内如何发生和被调控依然知之甚少。
2019年5月1日，英国 John Innes Centre的Caroline Dean研究组与清华大学李丕龙研究组合作在Nature杂志发表了题为Arabidopsis FLL2 promotes liquid-liquid phase separation of polyadenylation complexes 的研究论文。该研究发现，拟南芥coiled-coil蛋白FLL2介导RNA 3’末端加工因子的相分离，从而促进特定基因的3’末端形成。
该研究中，研究人员首先发现调节拟南芥开花的关键蛋白FCA能够形成nuclear bodies。有意思的是，FCA蛋白含有prion-like结构域且大部分区域高度无序，这是大部分能够发生相分离的蛋白所共有的两个特征【3-5】。这一发现让研究人员猜测FCA能够发生液-液相分离从而形成nuclear bodies。体内的一系列实验结果证明了这一猜测：FCA形成的nuclear bodies具有液滴的性质。体外重组的FCA prion-like结构域很容易发生相分离形成液滴，然而全长FCA蛋白却不能，暗示在细胞内FCA的相分离还需要其它因子的帮助。为了探究这一现象，研究人员利用正向遗传筛选，发现coiled coil蛋白FLL2是FCA发挥功能所必须的。有意思的是，FLL2与FCA共定位于nuclear bodies中。进一步研究发现，fll2突变体中FCA 几乎不能形成nuclear body，而过表达FLL2能够明显使FCA形成的nuclear body增大增多，说明FLL2能够在体内帮助FCA发生相分离形成nuclear bodies。
A working model for the role of the coiled-coil protein FLL2 to promote nuclear bodies that are important for polyadenylation at specific sites.
那么这些nuclear bodies对FCA的功能是否重要呢？Dean研究组早在1997年克隆了FCA，发现它编码一个RNA结合蛋白【6】。过去二十年，Dean研究组主要通过正向遗传学手段发现FCA控制特定转录本3’末端的形成【7, 8】，但是一直未能阐释该过程发生的机制。而在该研究中，研究人员建立了一种新的方法对FCA进行免疫纯化，通过质谱分析发现FCA与3’末端加工主要因子存在瞬时且动态的相互作用。这些3’末端加工因子与FCA共定位于nuclear bodies中。更重要的是，在fll2突变体中，FCA所控制的RNA 3’末端发生了缺陷。基于以上结果，研究人员认为FCA通过液-液相分离形成nuclear bodies，这些亚细胞结构能够富集3’末端加工因子，从而促进特定RNA的3’末端加工。该研究揭示了RNA3’末端加工的新机制，并首次发现coiled coil蛋白在液-液相分离中起重要作用，加深了我们对相分离机制的理解。
John Innes Centre博士后方晓峰、清华大学博士生王亮以及John Innes Centre博士后Ryo Ishikawa为本文共同第一作者，Caroline Dean教授和李丕龙研究员为共同通讯作者，John Innes Centre博士后李瑶曦也参与了该工作。
专家点评
蛋白质（及其他大分子）通过分子间相互作用聚集成直径达到亚微米级别的区室（而发挥功能）这一现象，近年来逐渐成为细胞生物学及生物化学领域研究热点中的热点。虽然在动物及微生物中研究的如火如荼，但植物中的相关报道还屈指可数。2016年Susan Lindquist教授实验室最早通过预测发现拟南芥中存在大量包含PrLD结构域的蛋白，其中包括多个开花调控因子；发现开花调节因子LD（与FCA同一遗传途径）在酵母中满足并表现Prion的特征。近期清华大学的李海涛教授及孙前文教授团队合作发现H3K9me2的reader蛋白ADCP1可能通过结合K9me而促进异染色质区的相分离；北京大学的来鲁华教授及瞿礼嘉教授团队合作报道了春化相关蛋白VRN1通过与DNA结合发生液液相分离。
John Innes Centre的Caroline Dean教授及清华大学李丕龙教授合作完成的这一工作，系首次在植物中建立了相变现象与体内蛋白功能间的强联系。该研究有几个亮点：首先这是一个很小心的工作，体内实验证明了在内源生理蛋白浓度下，FCA确实会发生液-液相分离，这一点尤为重要；其次参与调控FCA相分离的FLL2蛋白获得自针对FCA功能的正向遗传筛选，FLL2调控FCA相分离及转录终止，但却不影响FCA与RNA的结合，这为FCA的相分离和其分子功能间提供了一个强关联；第三该研究暗示了相分离对于转录终止这一基础过程可能是重要的。
该研究也引申出一系列等待回答的问题：转录终止是一个多蛋白协同调控的复杂过程，FCA调控的转录终止还依赖于其它蛋白，包括若干具有PrLD的蛋白（如FY, FPA, LD），他们是否及如何影响了FCA的相分离？FLL2不影响FCA与RNA的结合，那么RNA在FCA的相分离中是否及如何发挥作用？此外，转录终止是否严格的发生在聚集相而非弥散相？相信这些问题的答案对于理解相分离及转录终止机制可能都是重要的。
参考文献
【1】Shin, Y. and C.P. Brangwynne, Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science, 2017. 357(6357).
【2】Banani, S.F., et al., Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol, 2017. 18(5): p. 285-298.
【3】Molliex, A., et al., Phase separation by low complexity domains promotes stress granule assembly and drives pathological fibrillization. Cell, 2015. 163(1): p. 123-33.
【4】Patel, A., et al., A Liquid-to-Solid Phase Transition of the ALS Protein FUS Accelerated by Disease Mutation. Cell, 2015. 162(5): p. 1066-77.
【5】Kato, M., et al., Cell-free formation of RNA granules: low complexity sequence domains form dynamic fibers within hydrogels. Cell, 2012. 149(4): p. 753-67.
【6】Macknight, R., et al., FCA, a gene controlling flowering time in Arabidopsis, encodes a protein containing RNA-binding domains. Cell, 1997. 89(5): p. 737-45.
【7】Liu, F., et al., Targeted 3' processing of antisense transcripts triggers Arabidopsis FLC chromatin silencing. Science, 2010. 327(5961): p. 94-7.
【8】Simpson, G.G., et al., FY is an RNA 3' end-processing factor that interacts with FCA to control the Arabidopsis floral transition. Cell, 2003. 113(6): p. 777-87.
论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1165-8