甲贝课堂 | N-glycan糖型测试

蛋白质糖基化

蛋白质糖基化是指寡糖在糖基转移酶的催化下，与蛋白质多肽链上的某些氨基酸残基形成糖苷键的过程，糖基化的蛋白称为糖蛋白。作为一种重要的翻译后修饰，它普遍存在于膜蛋白和分泌蛋白中。在所有已知蛋白中，约有50％蛋白是以糖蛋白的形式存在的，而人类基因组中至少1％的基因参与聚糖生物合成[1]。糖基化蛋白质是细胞的主要成分，参与调节正常组织中分子识别、信号转导和细胞通讯等关键的生理代谢过程。

N-糖基化过程

N-糖基化是真核生物中最常见的糖基化形式，对应研究也比较成熟。真核生物在内质网进行核心糖化时，借助寡糖基转移酶（Oligosaccharyltransferase，OST）进行催化，从而将提前合成的糖链（核心糖链）转移至靶蛋白中保守的天冬酰胺（Asn）-×-丝氨酸（Ser）/苏氨酸（Thr）序列的Asn上，其中×代表脯氨酸（Proline，Pro或P）外的任何氨基酸。

图1：蛋白质N-糖基化及调控[2]

解决方案

蛋白药物的合成和分泌过程复杂，在生产、贮存及临床使用过程中均可能发生糖基化修饰。由于糖链长度及寡糖种类不同导致药物蛋白电荷及结构的异质性。除此之外，蛋白药物功能的实现与其糖基化修饰密切相关，它影响蛋白药物的构象、稳定性、溶解度、药物代谢动力学、活性及免疫原性等。鉴于糖基化在调节一系列复杂功能中所起的重要作用，所以糖基化是评价蛋白药物关键质量属性的一个重要指标。

甲贝医药通过PNGase F酶促反应，使糖蛋白上的N-糖苷与蛋白分离，再使用荧光试剂2-氨基苯甲酰胺(2-AB)对分离后的糖链进行衍生化标记，标记后的样品经UPLC分离，根据荧光检测器上出峰情况，使用面积归一化法进行相对定量。

图2：检测原理（来源：Doctor.7 ）

技术路线

图3：N-糖基检测步骤

案例展示

甲贝医药采用配备荧光检测器的UPLC（WATERS），搭配图谱处理软件“Empower^TM”。处理后的样品经色谱柱分离后，再由荧光检测器对信号进行检测，最终得到精确的分析结果。

图4：糖型测试出峰结果图

送样要求

1) 样品浓度≥ 2.0 mg/mL；

2) 样品形式：液体或制剂；

3) 保存方式：冰冻

参考文献

[1]  https://zhuanlan.zhihu.com/p/197243355

[2]  Moremen, K. W., Tiemeyer, M., & Nairn, A. V. (2012). Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function.Nature reviews. Molecular cell biology, 13(7), 448–462. https://doi.org/10.1038/nrm3383

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