甲贝课堂 | 蛋白药物糖基化位点分析

技术背景

作为一种重要的翻译后修饰（Post Translational Modification,PTM）,蛋白质糖基化（Protein glycosylation）是指碳水化合物分子通过共价键附着到蛋白质氨基酸侧链功能基团的过程，主要是聚糖（Glycan）与蛋白质结合生成糖苷键的酶促反应。N-糖基化（N-linked glycosylation）和 O-糖基化(O-glycosylation)是两种最常见的蛋白质糖基化类型（图1上）。通过对蛋白质进行复杂而精确的糖基化修饰，影响蛋白质在细胞内的折叠和运输，从而产生了丰富的蛋白质类型。这些丰富多样的糖蛋白在细胞内/间的信号转导、免疫调控和蛋白质稳定性等都发挥着重要作用（图2）。

图1 人体细胞中常见的糖基化类型[1]

• N-糖基化过程在内质网（Endoplasmic reticulum，ER）和高尔基体（Golgi apparatus，GA）中进行，聚糖通过与新生肽链中特定序列天冬酰胺(Asn)-X-丝氨酸/苏氨酸(Thr/Ser)中的游离氨基相连接。

• O-糖基化则可以发生在蛋白质序列中的丝氨酸/苏氨酸（Thr/Ser）残基的羟基上，多数在细胞表面表达和分泌的蛋白质都可以被聚糖修饰。不同类型的聚糖其单糖单元的数量、类型和顺序均不同，且由不同的酶催化合成。最常见的单糖有岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰氨基葡萄糖、唾液酸和木糖（图1下）。

图2 糖基化修饰调控多种蛋白功能[1]

检测原理

由于糖链的生物合成没有模板可以遵循,因此在同一个糖基化位点上会连有不同的糖链,造成所谓的微观不均一性。糖基化位点研究是理解糖链功能的重要前提之一，准确的捕获和分析糖基化的位点是我们理解其糖链功能的基础。

上海甲贝医药科技有限公司将根据客户需求，制定个性化的方案酶解样品，采用蛋白酶对供试品进行酶解处理，糖苷酶切除链接在肽段上的糖链后，依托专业高效的质谱技术平台，利用成熟的LC-MS/MS方法分离检测肽段混合物，并使用数据分析软件对LC-MS及二级碎片离子原始数据进行分析，确认脱糖后分子量与理论分子量的变化以及糖基化修饰的肽段序列，从而确定糖基化位点，提供糖基化位点的详细信息。

分析流程

图3 工作流程

案例展示

去糖及未去糖的样品的蛋白酶酶解肽段

1）经过LC-MS分离和检测，得到总离子流色谱（TIC）图，如图4所示；

2）通过UNIFI软件进行查库鉴定到的糖基化修饰肽段信息列于《表1》；

3）相应肽段的提取MS2图谱见图5。

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图4 供试品未切N糖（1）、切N糖（2）蛋白酶酶解产物总离子流色谱图（TIC）

表1 样品糖基化修饰肽段信息

• 备注：

1）同一位点本表仅列出其中一种糖修饰类型作为代表；

2）糖基化修饰的被糖苷酶切糖后发生脱酰胺化，分子量增加0.98 Da; 

3）G0F-GlcNAc分子量为1241.45 Da。

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图5.供试品未切N糖（上）、切N糖（下）的肽段（XXXXX）质谱（MS2）图

送样要求

1) 蛋白样品：量>100 μg；

2) 样品形式：液体、干粉；

3) 保存方式：低温（干冰或冰袋）

有关甲贝

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