甲贝课堂 | mRNA加帽效率测定
mRNA药物的分析表征
作为一种治疗性或预防性的药物产品，mRNA药物必须依照法规要求进行深入的分析表征。国家药监局药审中心发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》，提到对于mRNA体外合成需要进行过程和产物的控制检测，包括加帽率、加Poly(A)尾产物长度等。美国药典（USP）制定新的“mRNA疫苗质量分析方法”指南草案，支持mRNA疫苗和疗法的质量评估。
由于5’端帽子结构和3’ Poly(A)尾结构在mRNA的翻译及稳定性中起着重要的调节作用，因此测定mRNA的加帽效率及3’Poly(A)尾长度和分布是评价mRNA质量的重要指标。
▲mRNA药物的结构（图片来源：NATURE REVIEWS | Drug Discovery）
mRNA 5’加帽
mRNA 5'端帽子可以保持mRNA在翻译、拼接、聚腺苷酸化以及从细胞核导出等各环节中稳定性，并赋予体外转录mRNA对5'到3'外切核酸酶的抗性，从而延长mRNA的半衰期。
在真核细胞中,5'端帽子充当募集起始因子的锚点有助于核糖体对mRNA的识别和结合，使翻译得以正确起始。5'端帽子的结构和有效性能影响蛋白质的合成，从而影响能激发免疫应答的抗原的表达。
目前，体外转录mRNA常见的加帽方法主要有两种:酶法加帽和共转录加帽。
1. 酶法加帽
这种方法主要通过DNA作为底物，经过转录形成RNA，再经后续修饰成成熟的RNA。工业上最常使用的是牛痘病毒加帽系统（VCE）和2′-O-甲基转移酶对mRNA进行酶法加帽。
2. 共转录加帽
是在转录开始时就引入帽类似物，而后转录本沿着帽类似物继续延长，转录完后就可获得带有帽子结构的mRNA，这一过程避免了额外蛋白和底物的引入，工艺步骤也变得相对简单。
检测原理
甲贝医药mRNA加帽率的检测思路为：采用酶切方式获得5’端加帽或不加帽的寡核苷酸序列，随后通过液相质谱联用（LC-MS）分离鉴定不同大小的寡核苷酸片段，提供酶切片段的精确分子量信息，再结合理论酶切分子量，可以归属并得到样品加帽效率。
▶ 基于RNase H的mRNA加帽率分析：基于磁珠及RNAse H酶切，得到酶切后、带或不带帽结构的5’端寡核苷酸片段。
▶ 基于核酶的mRNA加帽率分析：DNAzyme，即脱氧核酶，该酶可以通过两端的结合臂与RNA结合，对RNA序列中的特异位点进行酶切。
分析流程
图4 工作流程
案例分析
Cas-9 RNase H酶切-LC/MS
归属结果：主要组分为Cap1和Gcap的加帽形式
Cas-9 DNAzyme酶切-LC/MS
归属结果：主要组分为Cap1和Gcap的加帽形式
送样要求
1) mRNA样品：>250 μg（浓度≥0.5mg/ml）；
2) 样品形式：液体、干粉；
3) 保存方式：低温（干冰）
有关甲贝
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