核酸适体-超顺磁纳米颗粒捕获结合铁载体-Fe3+清除碳点Biosensors and Bioelectronics ( IF 10.618 )
Pub Date : 2021-08-08
DOI: 10.1016/j.bios.2021.113551
检测人类粪便中的幽门螺杆菌感染是一种合适的非侵入性诊断方法。然而，抗体依赖性粪便抗原免疫测定面临许多挑战。因此，开发了一个独立于抗体的生物传感平台。该平台的核心是一个三模块生物传感器。第一个模块是用幽门螺杆菌特异性适体修饰的Ca2+掺杂的超顺磁性纳米颗粒，用于从样品中选择性捕获幽门螺杆菌细胞。第二个模块是氯原卟啉 IX 铁 (III)-聚乙二醇-去铁胺的双功能共聚物，可以高亲和力结合幽门螺杆菌并螯合Fe 3+来自 Fe 3+淬火碳点 (CDs) 溶液的第三个模块。当形成的模块1-幽门螺杆菌-模块 2复合物与模块3反应时，随后的磁分离可以清除Fe 3+，导致荧光从淬灭的 CD 中恢复，作为转导机制。该传感器可以响应Fe 3+浓度的微小变化，并具有可区分的荧光差异，从而赋予生物传感器高灵敏度、10–10 7 CFU/mL的宽检测范围和低至 1 CFU 的检测限 (LOD) /毫升。从模拟的人类粪便样本中，幽门螺杆菌用离心微流控板富集以消除基质的任何干扰，并使用生物传感器对细菌进行检测。耦合微流体和生物传感器的生物传感平台的实际 LOD 为 10 1，总时间为 65 分钟。这项工作展示了对粪便中幽门螺杆菌的即时、准确和超灵敏诊断。
方案1。用于检测幽门螺杆菌的生物传感器示意图;(a)生物传感器三个模块的化学结构。模块2中，血红素和去铁恶胺通过酰胺键与异双官能聚乙二醇(NH2-PEG-COOH)连接;(b)拟设计的幽门螺杆菌生物传感器的机制。
幽门螺杆菌是一种螺旋形的革兰氏阴性人类致病菌，会感染胃黏膜。幽门螺杆菌感染发生在发达国家25-50%的人口和发展中国家约70-90%的人口中。幽门螺杆菌感染在病因学上与慢性胃炎、消化性溃疡、原发性胃 B 细胞淋巴瘤和胃癌有关。因此，需要一种准确有效的诊断方法来检测感染，并且需要一种强有力的治疗策略来治疗患者。临床上，幽门螺杆菌的诊断主要依靠13 C-尿素呼气试验；但是，该测试只能在药物治疗完成后至少 4-8 周后进行。此外，由于辐射暴露，这种方法在儿童和孕妇中是禁忌的。由于敏感性和可接受性低，血清抗体检测和侵入性内窥镜检查也不适合儿童。考虑到上述缺点，从粪便样本中诊断H. pylori是一种可行的解决方案。然而，目前的粪便抗原检测有时会在细菌丰度低的情况下给出假阴性结果，并且如果最近在患者中使用了质子泵抑制剂或抗生素。2019 年开发了一种用于全细胞检测人类粪便样本中幽门螺杆菌的超灵敏传感器。它以“三明治”模式运行，它利用与磁珠结合的幽门螺杆菌单克隆抗体来捕获细菌细胞和幽门螺杆菌。幽门螺杆菌多克隆抗体与荧光量子点探针偶联用于信号转导。然而，在检测幽门螺杆菌时，需要一种更经济、更灵敏的替代方法来替代昂贵且耗时的抗体。在过去的几年中，适体已成为广泛多样性配体的高度特异性结合剂。适配体通过体外合成产生，不使用任何生物体，因此与抗体相比，提供了优越的免疫原性和稳定性以及更低的生产成本。对于许多传感器来说，荧光传感方法由于其高灵敏度而很有前景。迄今为止，在所使用的荧光团中，碳点（CDs）由于具有可调谐的光/化学性质、高荧光稳定性、良好的生物相容性、低毒或无毒以及成本效益等优点而变得流行，从而支撑了它们的潜在应用。作为生物成像探针、基因/药物递送剂和生物传感器以及其他化学或医学领域。CD可以作为电子供体和受体，它们的荧光可以通过电子转移与金属离子相互作用而猝灭。基于这种机制，人们开发了许多新型传感器来检测金属离子。目前，大多数基于 CD 的 Fe3+检测分析都是使用荧光关闭机制构建的，因为 Fe3+可以在结合时猝灭CD的荧光。有趣的是，当石墨烯碳点 (GQDs) 与 Fe3+的铁螯合剂无法竞争性地抓住Fe3+由于Fe 3+和GQDs之间的强相互作用，使GQDs 从 Fe 3+结合中解脱出来。因此，不能通过从 GQD 中恢复猝灭荧光来实现“关闭”传感器。尽管如此，假设使用更强的铁螯合剂从 CD 中清除 Fe 3+可以导致开发“开启”传感器，该传感器可以轻松测量“黑暗”背景下的微弱信号，以减少假阳性信号和提高灵敏度。铁载体由细菌和真菌在缺铁条件下产生，是一组对 Fe 3+具有高亲和力的低分子量化合物(400–1000 kDa)，缔合常数在 1012-1052。因此，它们可以螯合周围环境中极低浓度的 Fe3+。这种特性可以导致铁载体和Fe 3+之间的亲和力比EDTA和Fe 3+之间的亲和力更强，这可以有效地剥夺Fe3+从CD表面，因此导致从CD发射的荧光的恢复。基于这一点，可以开发一种具有高灵敏度的新型“开启”执行器。在实践中，原始样本，例如病理或食物样本，含有复杂的基质，它们会发出荧光并强烈影响荧光换能器的功效。目前，磁珠已广泛用于从样本中富集病原菌，例如用于从粪便中捕获幽门螺杆菌的免疫磁珠和从牛奶、饮料和水中捕获空肠弯曲杆菌。适体和化学抗体的结合亲和力相似。此外，与抗体相比，适配体具有多种优势，例如更广泛的通用性、更低的生物传感器限制和更低的成本。利用适配体修饰的磁珠可以轻松快速地从复杂基质中分离分析物，从而实现高信噪比的测量。因此，适配体修饰的磁珠或磁性纳米粒子是方便地从样品中捕获微生物的有前途的工具。此外，受生物传感的典型“三明治”免疫测定的启发，第二个高度特异性的配体应用于介导传感器的传感/驱动模块与幽门螺杆菌之间的亲和结合。已经阐明，包括幽门螺杆菌在内的革兰氏阴性菌可以通过主动运输和利用宿主的血红素来规避宿主的铁营养免疫。这表明使用氯原卟啉 IX 铁 (III) (hemin)，一种在体外稳定且易于获得的血红素氧化形式，作为可能赋予幽门螺杆菌特异性的配体分子。基于这些数据，进行了一项研究，以开发一种独立于抗体的“off-on”生物传感器，该传感器使用化学合成的元素与生物衍生分子（包括适体、血红素和铁载体）结合构建，用于体外全细胞检测幽门螺杆菌。该生物传感器被设计成具有以下模块（方案1a ）：1）用幽门螺杆菌修饰的Fe3O4超顺磁性纳米颗粒-特异性适体（SPMNPs@aptamer）作为细菌富集模块；2）合成的血红素-聚乙二醇（PEG5000）-去铁胺共聚物（Hemin-PEG-DFO）作为双功能靶向和驱动模块；3) Fe 3+淬灭的CD溶液(Fe 3+ /CDs)作为转换模块。SPMNPs@aptamer 有望通过磁分离从水溶液中捕获和富集H. pylori细胞。随后，预计血红素-PEG-DFO 共聚物通过血红素与捕获的幽门螺杆菌细胞结合，形成 SPMNPs@aptamer-幽门螺杆菌-共聚物复合物。该复合物还有望螯合 Fe 3+中的铁离子/CDs 溶液，它通过磁性分离的 Fe 3+清除开启了 Fe 3+猝灭的 CDs的荧光（方案1b）。在获得这三个模块后，详细说明了这种三模块生物传感器的工作条件。此外，人类粪便与幽门螺杆菌人工混合以模拟病理标本。为了减少粪便内容物对生物传感的干扰，离心微流体 被用于从粪便样本中分离和富集细菌。将获得的样品置于上述设计的生物传感器中，以验证幽门螺杆菌的检测。细胞微流控板与生物传感器的耦合共同构成了幽门螺杆菌检测的生物传感平台。已经详细介绍了使用这种微流体辅助生物传感平台检测粪便幽门螺杆菌的效率，并描述了其在实际应用中的潜力。该生物传感平台极有可能克服目前幽门螺杆菌非侵入性诊断中的障碍。