​【Biosens.Bioelectron】利用细胞内ROS传感平台进行实时细菌检测

利用细胞内ROS传感平台进行实时细菌检测

Biosensors and Bioelectronics ( IF 10.618 )

Pub Date : 2019-06-19

DOI: 10.1016/j.bios.2019.111430

强调

• 由 CNT 线构成的纳米结构电极形成巨噬细胞全细胞电化学生物传感器。

• 使用检测限在纳摩尔范围内的过氧化氢酶模拟物选择性检测过氧化氢。

• 用 3 秒的革兰氏阴性细菌感染检测巨噬细胞 ROS 的产生。

• 在巨噬细胞中感应到的 ROS 表明先天免疫系统对细菌的反应是动态的、快速的和不同的。

活性氧是高活性分子，不仅在全身广泛表达，而且还与包括细菌感染在内的许多疾病和障碍有关。目前的技术在准确检测和鉴定特定活性氧方面的成功有限。为了解决这个问题，开发了一种电化学生物传感器，它由单壁碳纳米管构成，这些碳纳米管固定在用锇基化合物功能化的氧化铟锡表面上。该传感器集成在具有多种血清型的小鼠巨噬细胞 (RAW 264.7) 中用于启动免疫反应的细菌。然后测量细胞内过氧化氢，以响应存在于革兰氏阴性菌外壁上的脂多糖与 Toll 样受体 4 的相互作用。实施 n-乙酰半胱氨酸和丙酮酸钠以证明特异性传感器朝向过氧化氢。

发现传感器具有 368 nM 过氧化氢的检测下限。在细菌与巨噬细胞相互作用的 3 秒内检测到细胞内过氧化氢的增加。这种低检测限与传感器的快速响应相结合，在时间水平上实现了前所未有的过氧化氢检测以前从未见过应对细菌威胁。从所测试的三种革兰氏阴性菌血清型中，过氧化氢的产生存在明显差异。这证明了先天免疫系统在感染后在适应性免疫系统激活之前具有动态快速反应的能力。

图 1：CNT生物传感器和哺乳动物巨噬细胞之间的界面示意图(RAW 264.7)，突出了感兴趣的生物途径。简而言之，来自革兰氏阴性细菌的LPS激活 TLR-4，然后触发细胞内活性氧物质的产生，这些活性氧物质可以通过与 CNT 的电子交换被检测到并被检测到。

活性氧(ROS) 是一类通常源自氧代谢的分子，除过氧化氢和氢氧根离子外，ROS 都是在其外壳中具有不成对电子的自由基。这使得 ROS 具有高反应性并能够作为各种靶蛋白的快速氧化剂。ROS 以严格控制的方式普遍表达，并在生物学中发挥着不同的作用，这取决于它们的浓度和位置。除了它们在正常细胞功能中的作用外，ROS 在它们被上调的各种疾病和炎症中发挥着复杂的作用。

众所周知，ROS 与许多不同的疾病有关，包括帕金森氏症、关节炎、炎症和败血症。细胞内 ROS 的浓度可以决定细胞是否正常分裂和生长或触发细胞凋亡，例如，已经表明浓度低于 0.7 μM 的过氧化氢支持增殖，在 1 和 3 μM 之间触发细胞凋亡，超过 3 μM 的浓度会导致细胞坏死。由于 ROS 在细胞生命和死亡中的不同作用，它们是一个重要的研究课题；然而，由于它们的高反应性和瞬态特性，测量非常困难。

ROS 在免疫细胞内产生以响应细菌感染。嵌入革兰氏阴性菌外膜的脂多糖(LPS) 与存在于包括巨噬细胞在内的许多细胞类型上的 Toll 样受体 4 (TLR4) TLR4 具有多个细胞内信号结构域，这些结构域在激活时被募集。产生 ROS 的一个关键信号域是髓样分化因子 88 (MyD88)。然后 MyD88 负责白介素 1R 相关激酶 4 (IRAK-4) 与 TLR4 的关联。结合后，IRAK-4 会自动磷酸化并离开 TLR4/MyD88 复合物与肿瘤坏死因子受体相关因子 6 (TRAF6) 相互作用。正是这种相互作用是产生 ROS 的关键。

IRAK4和 TRAF6之间的相互作用可以激活 NF-κB 和 MAPK 途径，重要的是，激活另一个膜结合蛋白质：NADPH 氧化酶(NOX)，通过一种 NOX 细胞内亚基的磷酸化。NOX 蛋白家族通过氧化产生超氧自由基NADP 生成 NADPH 以及将氧气共同还原为超氧化物来产生超氧自由基。然后超氧化物又形成过氧化氢。哪个信号通路被激活被认为取决于以时间依赖性方式产生的 ROS 。例如，长时间和扩散的 ROS 产生被认为是细胞通过非特异性氧化损伤激活凋亡途径的触发因素。LPS 的两大类是光滑的（野生型，WT）和粗糙的 LPS。与光滑的 LPS 相比，粗糙的 LPS 在长度上被截断，并绕过细胞护送系统到 TLR4，通常导致更大的 ROS 反应。LPS 与 TLR4 的这种相互作用可能产生的各种结果可以解释先天免疫系统如何对不同的细菌血清型。开发一种准确检测 ROS 的技术对于阐明它们在先天免疫系统中的作用至关重要。

因此，一种理想的 ROS 检测技术需要能够以时间敏感的方式选择性地检测细胞内 ROS。该技术还应该相对便宜且易于构建以便商业化。无需额外的专业设备即可轻松获得测量结果。尽管有大量可以在某种程度上使用的方法库，但目前不存在这种技术。

多年来，荧光探针一直是 ROS 检测的先行者，因为它们广泛可用并且有数十年的论文支持。虽然它们的商业可用性对于用户访问很重要，但它们有许多优点和缺点，Gomes 和 Winterbourn 已经彻底审查了这些优点和缺点。

基于电化学的传感器自 1950 年代初就出现了，并迅速成为传统荧光探针的竞争对手。电化学传感器基于特异性识别元件和将生物事件转换为电信号（例如转换为电流变化的浓度变化）的传感器。该换能器元件允许快速检测系统，不依赖于化学反应或潜伏期像许多传统方法一样。识别元件的适应性还允许对感兴趣的分析物具有特异性。

电化学传感器的这些组件与它们的小尺寸（纳米到微米）相结合，使其成为细胞内和细胞外分析物的极其有利的检测方法。由于其多样化的应用和极高的适应性，许多电化学传感器已被开发用于检测生物相关化合物，通常使用过氧化氢的存在作为不同目标分析物的指示剂。直到最近几年，该技术才被用于直接检测细胞内 ROS。电流型 电化学生物传感器测量与目标分析物浓度成正比的电流变化特别常见。

研究 ROS 在免疫系统中的作用的第一步是开发一种传感器，该传感器可以特异性地检测和区分 ROS 家族的一个成员。在这项工作中，展示了一种细胞内生物传感器的进一步开发，该传感器可以以浓度和时间依赖的方式检测过氧化氢，以响应细菌的询问，这建立在之前开发传感平台的工作的基础上 。

利用单壁碳纳米管(SWCNT) 构建了一个电流传感器，该单壁碳纳米管用模拟过氧化氢酶的锇基电催化剂进行了改性行为，之前已经证明可以将传感器插入细胞内部。然后，这些传感器 (ITO-SWCNTs-Osby) 用于研究当暴露于从细菌中分离的 LPS 时，巨噬细胞内迅速产生的不同过氧化氢反应。图1 显示了细菌如何在细胞内诱导过氧化氢，以及如何通过安培生物传感器对其进行检测的概述。导致过氧化氢检测的详细电催化机制可以在我们最近的出版物中找到。