【Angew.Chem.Int.Ed】荧光酶级联荧光素合成和农药检测
Angewandte Chemie International Edition ( IF 15.336 )
Pub Date : 2022-02-09
DOI: 10.1002/anie.202116908
开发了酶促反应，将19种含有卤素、硝基和甲基取代基的酚类衍生物转化为 8 种 D-萤光素类似物，包括新型化合物4',5'-二甲基-D-萤光素和5'-甲基-D-萤光素。发出比天然D-荧光素更亮和更长波长的光。这些反应促进了发光技术的进一步发展，用于灵敏检测有机磷农药。
D-荧光素(D-LH 2 ) 是萤火虫荧光素酶 (Fluc) 的底物，对于广泛的生物发光应用非常重要。这项工作报告了一种新的绿色方法，使用酶促反应（帮助，用于制备荧光素的 HadA 酶）将19种酚类衍生物转化为8种D-LH 2类似物，产率约为 51%。
该方法可合成自然界从未合成或发现的新型5'-甲基-D-LH 2和4',5'-二甲基-D-LH 2 。5'-甲基-D-LH 2 比 D-LH 2发出更亮和更长波长的光。使用 HELP，我们进一步开发了 LUMOS（有机磷及其衍生物的发光测量）技术，通过耦合 OPs 水解酶和 Fluc 的反应，原位检测有机磷农药 (OPs)，包括对硫磷、甲基对硫磷、EPN、丙溴磷和杀螟硫磷。LUMOS 技术可以以万亿分之一 (ppt) 的水平检测这些OP。该方法可以直接检测食品和生物样品中的有机磷，无需样品预处理。
荧光素酶催化的生物发光或光发射是一种强大的分析方法，可用于生物医学研究1以及检测食品和环境中的毒物。大约30%的高通量筛选 (HTS) 实验采用生物发光检测。尽管存在各种类型的萤光素酶，但以D-萤光素 (D-LH 2 )为底物的萤火虫萤光素酶 (Fluc) 仍然是最常用的系统之一，因为它具有高量子产率，可产生具有最大发射 ( λ max ) 在 ≈560 nm。
D-LH 2的修改获得具有更亮和更长波长光发射（>600 nm）的类似物是创新发展的关键，以扩大和增强 D-LH 2在更广泛应用中的用途。更亮和更长波长的光可以有效地穿透细胞和组织隔室，促进细胞系和动物模型中的实时生物发光成像。这对于根据 3R（替换、减少和优化）规则最大限度地减少资源和动物利用非常重要。不同颜色的生物发光还为不同的检测目标（如基因或分析物）提供不同的信号。D-LH2类似物虽然存在，但并未广泛使用，它们的制备需要特殊的专业知识才能在 120–190 °C 下使用有毒化学品如吡啶、乙酸酐 (Ac 2 O)、二甲基甲酰胺 (DMF) 处理多达 9 步反应，和环丁砜。
农药的大量使用和接触是世界上最严重的健康和不平等问题之一。克服这一问题的解决方案是联合国提出的 17 个可持续发展目标（可持续消费和生产）的一部分。在发展中国家，农药的使用量被认为非常高（即 2012 年有机磷农药 (OPs) 的使用量约为 2000 万磅/年），造成近 300 万起农药中毒事件，导致 22 万人死亡（主要是农民）每年。
农药残留污染无论是原始形式还是代谢形式，例如 OPs 降解产生的卤化和硝基苯酚衍生物，都会对人类和动物的生活产生深远的影响，因为这些化合物可以长期沉积在食物链和淡水水库的各个层面，导致慢性疾病，例如癌症、阿尔茨海默氏症和 II 型糖尿病疾病。
除了农药降解，这些酚类有毒物质还来自生产农用化学品和家用化学品（如阻燃剂）的行业。因此，生物、食品和环境样品中这些化合物的污染水平受到美国环境保护署 (US-EPA) 和欧洲经济区 (EEA) 的严格监管。因此，检测其痕量的技术对于预防健康危害非常重要。
之前，已经证明 4-硝基苯酚 (4-NP, 1 a ) 或 4-氯苯酚 (4-CP, 1 b ) 可以通过 HadA 单加氧酶反应转化为苯醌 ( 2 )，得到的化合物2可以与D-半胱氨酸 (D-Cys) 缩合形成天然D-LH2。该反应可以与 Fluc 的反应相结合以产生1a和 1b的可检测信号。然而，获得的最佳 D-LH 2产率仅为 ≈21%，这对于散装 D-LH 2是不实用的 准备。此外，报告的技术没有检测到原始形式的农药。
HELP( H adA E nzyme for L uciferin P reparation)反应包括耐热的HadA、黄素还原酶(C1 )和辅助酶，可以在温和条件下在水溶液中合成D-荧光素类似物。结合对硫磷水解酶(Opd)和Fluc 的反应，LUMOS(Lu minescence Measurement of O rganophosphate and Derivative s ) 平台可以检测OPs家族的农药（对硫磷、甲基对硫磷、EPN、丙溴磷和杀螟硫磷）及其通过生物发光以万亿分之一 (ppt) 的水平在生物和食品样品中特异性和定量地代谢产物。
在这项工作中，开发和设计了生物催化剂，使其成为一种新的原型单锅酶级联反应，称为 HELP（用于制备荧光素的 HadA 酶），其中包括 HadA 单加氧酶、黄素还原酶 (C1 )和辅助酶（辅因子再生、自由基清除酶和多酚氧化酶），用于从19种含有卤素、硝基和甲基取代基的酚类衍生物方便有效地合成 8 种D-LH2类似物（包括两种新型荧光素），产率约为 51%。
这种酶级联反应结合了绿色化学和白色生物技术原理，允许非专家轻松制备 D-LH 2类似物。所有D-LH2类似物产生与天然D-LH 2不同的发光特性，特别是溴和甲基 D-LH 2类似物，其λ最大值大于 600 nm。该方法还产生了两种新型D-LH2类似物，5'-甲基-D-LH 2 (5'-Me-LH 2 ) 和 4',5'-D-二甲基-LH 2 (4',5'- DiMe-LH 2 )，以前从未在自然界中合成或发现过。5'-Me-LH 2发出比天然 D-LH 2更亮和更长波长的光。
进一步使用 HELP 反应开发了 LUMOS（有机磷酸盐及其衍生物的发光测量）技术，通过将反应与 Fluc 和 OPs 代谢酶（例如对硫磷水解酶，Opd）的反应耦合来原位检测 OPs（图 1）。该检测技术可以检测五种芳香族有机磷农药，包括对硫磷、甲基对硫磷、O-乙基O-对硝基苯基硫代膦酸盐（EPN）、丙溴磷和杀螟硫磷，可用于检测这些农药的存在直接在尿液、血清和食物样品中，无需样品预处理。
除了促进 D-LH 2的合成类似物及其在农药灵敏检测中的效用，HELP 反应举例说明了用于废物循环经济的绿色酶溶液，其中有问题的毒物可用于合成有价值的D-LH 2及其类似物（天然 D-LH 2 ≈206 美元/毫克，Sigma-Aldrich）。
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