​【Nat.Biomed.Eng】以单核苷酸分辨率比色检测SARS-CoV-2变体的纸质检测方法

以单核苷酸分辨率比色检测 SARS-CoV-2 变体的纸质检测方法
Nature Biomedical Engineering ( IF 29.234 ) 

Pub Date : 2022-07-14

DOI: 10.1038/s41551-022-00907-0

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的演变突出了对能够区分新出现的病毒变体的多功能诊断分析的需求。在这里，报告了一种廉价（每次测试大约0.30美元）检测的开发和性能基准测试，用于快速（30分钟内从样本到答案的时间）比色检测SARS-CoV-2变体。整合到可折叠纸条中的测定利用核酸链置换反应、与单碱基对错配相关的热力学能量损失和尿素的金属离子控制酶促切割来放大对病毒RNA的识别通过智能手机比色读出pH值的变化。对于50个咽拭子样本，该测定同时检测到SARS-CoV-2的存在以及SARS-CoV-2变体Alpha、Beta和Gamma特有的突变，与实时定量聚合酶链反应和RNA测序100%一致。用于检测病毒及其变体的可定制且廉价的纸质化验可能有助于病毒监测。

TEprobe是一种双链DNA探针，它可以通过调整末端的前移脚点和倒移脚点序列来精确控制输入rna诱导的链位移反应的净热力学能。突变病毒rna和野生病毒rna可以通过链置换反应来区分，这是基于单碱基对失配产生的热力学能量惩罚。对病毒rna的识别导致尿素酶抑制剂金属离子Ag(I)的释放，从而控制尿素的裂解和NH4+的水平。利用pH指标识别和可视化SARS-CoV-2变异的关键突变标记，如Alpha、Beta、Gamma和Delta。诊断结果由智能手机确定并呈现给用户。

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)的快速演变对当前抗击大流行的战略(如疫苗接种)提出了挑战，并已成为大流行中最紧迫的问题。然而，目前还没有负担得起和可扩展的诊断工具来检测SARS-CoV-2变异，这阻碍了它们的诊断和流行病学监测。新出现的变异增加了关于病毒传播、致病性和疫苗有效性的不确定性。

例如，阿尔法(也被称为B.1.1.7或501Y.V1)变种比前一个世系的传播率高43%至90%，死亡风险高61%。Beta(B.1.351或501Y.V2)变异导致AZD1222疫苗的临床疗效从70%下降到22%，NVX-CoV237疫苗的临床疗效从89%下降到49%(参考文献)。据报道，一种具有E484K和D614G突变的SARS-CoV-2变种能使疫苗突破感染。Delta(B.1.617.2)变种在印度引发了第二波SARS-CoV-2感染，每天造成30多万例新病例，并迅速蔓延到世界各地。面对这种威胁，能够对SARS-CoV-2变种进行可扩展测试的工具将帮助我们准确评估SARS-CoV-2的感染和致死风险，快速隔离高危或缺乏疫苗的感染者，从流行病学角度评估SARS-CoV-2的演变，并有效指导疫苗的使用和迭代开发。

然而，目前还没有能够让我们快速解析SARS-CoV-2突变并识别其变异的工具。理想情况下，可扩展的SARS-CoV-2变异筛查工具应能够(i)检测病毒RNA中的单核苷酸突变，(ii)提供较短的样本到结果的周转时间，(iii)提供识别多种变异的多路复用能力。逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)是诊断SARS-CoV-2的金标准核酸检测方法。环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增和基于核酸序列的扩增等等温扩增策略，或整合CRISPR-Cas系统等替代PCR的进展，减少了对笨重温控仪器的需求，缩短了检测时间，从而有助于资源有限地区的SARS-CoV-2诊断。使用雅培IDNow和CepheidGeneXpert的即时核酸检测已经获得了美国食品和药物管理局的授权。然而，上述方法通常需要核酸扩增，增加了SARS-CoV-2检测的复杂性和试剂成本。此外，通过杂交鉴别或酶基识别等方法识别病毒RNA中的单核苷酸变化具有挑战性，这些方法尚未进一步发展以解决SARS-CoV-2变异。基于crispr-Cas的核酸检测有望利用Cas蛋白的序列识别能力来检测遗传变异16,24,25。

然而，靠近固定序列的3-6nt的有限的核苷酸突变敏感区域，如邻近的原间隔基序20,26，可能会阻止基于crispr-cas的诊断覆盖SARS-CoV-2中一些感兴趣的核苷酸突变，其潜力迄今尚未充分探索用于检测临床样本中的SARS-CoV-2变异。迄今为止，唯一可用的分析SARS-CoV-2变种的策略是测序，这一方法的使用受到了阻碍，特别是在资源有限的地区，原因是基础设施短缺，以及高劳动强度和成本。