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教你用 Image J 进行细胞自动计数!

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对科研小白来说,论文作图往往是一件非常烦恼的事情。今天一文让小白精通科研作图


首先,我们大部分看文献的时候,论文里面的图片如下,要么好几张图片组合在半栏图,要么要几张实验图组合在一个全栏里面:



那么,作图的软件及流程是什么,如下:



也就是用SPSS、origin等做好的统计图,PS处理好的实验图,然后导入AI里面组合好;最后导出矢量图或者位图,用于投稿。


一、对于SPSS,我们分享过:

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二、对于Origin,我们分享过:

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那,组合图好之后,最后我们就需要导出,AI导出的时候,不同的期刊对图片的大小、格式、色彩模式、分辨率等均有要求。如下:



首先是格式:矢量图没有分辨率的问题。因为矢量图可以任意缩放而保持清晰度不变,位图在放大后图片会变模糊,出现马赛克般的像素小点。所以,我们组合好图片之后需要保存为PDF或者EPS属性的矢量图:



其次是分辨率:如果我们用AI导出为位图(PNG\TIFF等),建议彩图、照片分辨率 > 300 dpi,灰度图 > 600 dpi,黑白图 > 1200 dpi。同时,请保存好源文件格式,方便以后修改。另外,photoshop 不能提高位图的分辨率,仅增大该图所占内存,得到虚假的高分辨率图片(所以这里建议,组图一定要用AI)。


最后是颜色:导出的时候,会让我们选择色彩模式,作图中常用的模式有两种,RGB 和 CMYK。若投稿期刊未做要求,建议使用 RGB 模式,色彩表现力比较强,适合投稿后编辑和审稿人的阅读。



那懂了这么多之后,我们先一点一点学习。今天教大家:Image J 细胞计数。


1、打开图片之后,Image-Type- 8-bit,改为灰度图像,便于后面的利用阈值来自动形成选区;



这一步之后可以反向(Edite-Invert)、可以调节对比度(Image-Adjust-Brightness/Contrast)、可以提高对比度(Process-Enhance Contrast)……甚至可以在打开图像之后就将图像转变为HSB模式(一种和RGB、CMYK等并列的颜色模式),选择其中一个对比度比较大的通道(一般是亮度(Brightness)通道)进行复制,然后用于计数。这些辅助步骤都是为了使得被计数对象能够与背景区分更加明显,所以你在不同的教程里面会看到略有差异,当然如果比对明显,也可以什么都不做,比如本文用的例图就什么都不需要做~~


2、Image-Adjust-Threshold,调节阈值(Threshold),默认采用红色蒙版代表选区,当然你也可以修改,但是没必要。由于待测物体的颜色(灰阶值)相差很小,却与背景的灰阶值存在显著差异,通过所谓的阈值(Threshold)就可以设定待测物体灰阶值的上下限,来批量、自动地界定待测物体的选区。所以,如果待测物体与背景值灰阶值区分不大,或者待测对象灰阶值不均匀,则不能通过这种方法来进行自动选取。


下图红框左边表示能够自动识别选区的方法,一般使用Default(默认),右边表示蒙版的颜色或形式,默认红色就挺好;至于下面几个参数基本也用不到,默认就好;



默认的各种选区识别方法参数可能不尽人意,你可以使用上面两个滑块调节灰阶范围,同时观察图片中红色蒙版覆盖的物体,尽量将你需要计数的物体都盖进去,



3、点击Apply;会自动对图像进行二值化(Binary,简单地说是让图片“非黑即白”)处理,便于下一步统计;



4、有些细胞连在一起了,所以要把它们分开,计数成两个细胞;image J本身提供一个所谓的“分水岭(Watershed)”法来分割细胞连接,Process-Binary-Watershed;这种方法对于规则细胞或规则物体是比较适用的,如果待计数物体不规则,就很容易出现分割错误。



下图白色分割线就是这个方法产生的效果。



5、点击Analyze-Analyze Particles,弹出如下界面;



左边三个框都勾选,分别表示展示分析结果、清除上一次分析的结果、以及本次结果的Summarize;如果在后续的分析中不需要用到刚刚采用阈值(Threshold)自动形成的选区,左边第四个框也不用勾选;右边第一个框表示排除边缘物体,也就是边缘的半个细胞要不要计数;右边第二个表示允许包括洞,为什么会有洞呢?如果待测物体灰阶值不均匀,比如某物体边缘黑中间白,那么就会形成一个洞,这个洞很显然不能算一个计数,可以勾选该选项去除。也有人会在第3步和第4步之间添加一个补洞步骤:Process-Binary-Fill Holes,这里没洞,就没做了。


最重要的是最上面可以通过Size(大小)和Circularity(圆度)来对要计数的对象进行筛除,比如本例图中有一些小黑点明显不是细胞,那么可以通过设定Size的下限来排除。

那如何获得正常细胞大小或者圆度的区间呢?一般是通过Wand Tool(魔棒工具)来选择并实际测量几个正常细胞,估计一下区间,然后把上下限值填入最上面的两个选框中。(关于魔棒工具等基本工具以及测量工具本来想先写一些推文的,一打开软件就忘了,先写了计数这篇,以后补上)。

下面的Show是结果展示形式,一般选择“Outline”就行,其他效果有兴趣的自己试一下。

6、最后会获得三个结果:Outline结果图,每个细胞有轮廓有计数;详细的Results列表;Summary,从Summary可以看到计数结果(Count)为52,还有其他一些统计量。


好了,最后我们还有:


“Image J处理各种科研论文图视频教程”


如做细胞追踪等:



目录如下(含软件安装包):



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