核酸提取—DNA
作为一切分子生物学研究的基础，核酸的提取永远是开展一项研究的第一步，提取核酸的质量高低是下游分子生物学实验成败的关键。本文将会详细介绍关于DNA提取的相关信息，包括DNA提取的原理、提取过程的注意事项、不同类型样品DNA的提取推荐方法等等。
DNA提取的基本原理
DNA的提取可以简单的分为裂解和纯化两大步骤，裂解是破坏样品细胞结构，从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程，纯化则是使DNA与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
裂解过程
常规的裂解液都含有去污剂 (如SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl等)。
去污剂的作用
使蛋白质变性；
破坏膜结构；
去除与核酸相互作用的蛋白质。
盐的作用
提供合适的裂解环境，如Tris;
抑制核酸酶对核酸的降解，如EDTA；
维持核酸结构稳定，如NaCl。
裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进DNA与蛋白质的分离，同时，也便于后续的纯化操作。
纯化过程
酚氯仿抽提
该方法包括两个步骤：
利用酚氯仿对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现DNA与蛋白质的分离；
再用醇将DNA沉淀下来，实现核酸与盐的分离。
酚氯仿抽提是去除蛋白质的有效手段，但如果蛋白质含量超过了其饱和度，裂解体系中的蛋白质就不会被一次性去除，需要进行多次反复抽提，而每次的抽提均会导致核酸的损失。
酚氯仿抽提最大的优势是成本低廉，对实验条件要求较低。
高盐沉淀法
高盐沉淀法是酚氯仿抽提方法的一个变种，其省略了酚氯仿抽提操作的麻烦，并且几乎克服了酚氯仿抽提方法的一切缺点，只是得到DNA的纯度不够稳定。
离心柱纯化
该方法利用某些固相介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离，是目前试剂盒提取广泛使用的方法。
该方法受人为操作因素影响小，提取DNA的纯度稳定性很高，其缺点是当样品过量时，需要反复进行离心，对样品的提取效率较低。
磁珠法
该方法将纯化介质包被在纳米级的磁珠表面，通过介质对DNA的吸附，在外加磁场的作用下使DNA附着于磁珠并定向移动，从而达到核酸与其它物质分离的目的。
与其它集中方法相比，磁珠法具有无可比拟的优势，包括：
提取灵敏度高 (只需微量的样本)；
纯化的纯度高 (能够使核酸完全与杂质分离)；
提取产量高 (每mg磁珠能吸附500μg DNA)；
分离速度快 (磁场分离只需几秒钟)；
自动化操作 (通过机器自动完成操作过程，无需人力)；
高通量提取 (可同时完成数百个样品的提取)；
无毒无害无污染 (试剂中不含任何有毒物质)。
该方法依赖于磁力分离装置或自动提取仪，目前价格依然很高，并不适用于小型实验室常规实验。
DNA提取的注意事项
样品的采集和保存
样品的采集和保存是DNA提取的第一步，合适的样品采集和保存方法对于DNA提取的成败至关重要，尤其是有些珍贵样品，其采集和保存的方式更是需要特别关注。
动植物样品的采集
动物的内脏和皮肤样品要在动物死亡后2h以内采集，通常采集多个重复，切成小块保存在消毒后的离心管中；
动物呼吸道样品通过棉拭子进行蘸取，完成采样后立即置于5mL磷酸盐缓冲液中；
动物血液样品采集后，立即加入抗凝剂，封口病竖立插入样品盒，尽量不要使用肝素抗凝；
植物样品采集时优先选取核酸含量较多的部位，如植物的幼嫩部位；
采集植物样品时建议使用无菌水或75%乙醇擦拭或冲洗干净，再用吸水纸吸干样品表面液体。
微生物相关样品采集
针对微生物研究相关的样品，首先要避免人源污染，采样的器具都应经过高温灭菌，采样过程中要戴手套。
其次要关注样品运输和处理的速度，很多环境微生物研究的样品并非来自实验室，而是来源于自然环境，有些样品的采集位点甚至在人迹罕至的地区，这就涉及到样品的运输问题。最理想的样品运输条件是在液氮中冷冻运输，如没有条件也可将样品装入含有冰袋的泡沫箱中运输，如样品运输距离较远、时间较长，最好选择专业的冷链运输公司。
针对水体样品微生物群落的研究，需要用抽滤的方式将样品中的微生物浓缩至滤膜上，之后再提取其DNA，通常情况下普遍认为采用0.22μm孔径的滤膜进行抽滤能够收集到水体样品中的完整微生物群落。
有时我们会首先使用0.8μm孔径的滤膜对水体样品进行预处理，以去除大的颗粒物质，之后再用0.22μm滤膜收集微生物，这时会遇到一个问题，就是去除的颗粒物质也会吸附一部分微生物，因此造成了最终收集的微生物样品不完整，本人之前的一篇文章就被审稿问了这个问题，所以在进行样品处理的时候，一定要首先明确要研究的是被颗粒物吸附的微生物、还是游离态的微生物、或者是完整的微生物群落，以确定最适合的抽滤方案。
样品的保存
绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。如果组织样品不能马上进行DNA提取，短期内可以冷冻于-20℃，稍长时间的保存可以采用无水乙醇进行固定。
此外还推荐另外一个可以长期保存的方法 (适用于有钱人)，可以使用QIAGEN公司的RNAlater进行组织样品的保存，这个试剂不仅可以保存RNA，同时也能够防止DNA的降解，本人之前有过保存了一年左右的样品，DNA提取的效果同样很好。
DNA提取方法的选择
开展针对某个实验样品的DNA提取之前，一定要先行收集该样品的特性信息，例如该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量等，否则就会造成DNA提取失败，从而无法开展后续实验。只有对实验样品有所了解，才能正确选择DNA提取方法。
含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。蛋白酶的作用是分解蛋白质，从而使蛋白质变小，促进蛋白质的游离，基因组DNA是很容易“缠”住其它生物大分子物质，蛋白质被蛋白酶消化变小后，不容易被基因组DNA“缠”住，有利于蛋白质在纯化过程中被去除，使最终获得的基因组DNA的纯度更高。
含CTAB的裂解液，是针对富含多糖样品 (如细菌、植物等) 基因组DNA抽提的首选裂解方法。CTAB的质量对裂解效率有很大的影响，尽量使用高纯度的CTAB，并且不要轻易更换生产厂家。CTAB的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，一般使用65℃，但如果发现DNA降解严重或者得率太低，可以尝试在37～45℃进行裂解。
当对大量纯培养细菌进行PCR鉴定时，可以直接使用未裂解的菌体当作模版进行PCR，只需延长PCR预变性的时间，即可在该阶段完成菌体的裂解并释放DNA。但是该方法由于没有经过纯化的过程，因此可能出现一定的假阳性，该方法最适合从大量菌株样本中筛选含有特定基因的目的菌株，但是并不适合判断某一特定菌株是否含有目的核酸片段。
DNA的保存
提取得到的DNA通常使用TE buffer进行最后的溶解，其含有的EDTA可以减少DNA被可能残留的DNase降解的风险，但是如果提取方法合适、操作得当，则几乎不会残留DNase，使用无菌水溶解DNA也是可以的。
提取到的DNA一般情况下在-20℃保存是没有问题的，但是要避免反复冻融，因此，最好在提取完成之后按照后续实验所需进行分装，这样每次使用一个分装好的DNA，避免反复冻融造成的DNA降解。如果提取的DNA需要长期保存 (一年以上)，最好保存于-80℃。
DNA提取试剂盒推荐
动植物及纯培养微生物样品DNA提取试剂盒推荐
| 样品类型 | 推荐试剂盒 |
|---|---|
| 培养的细胞 | TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit (TaKaRA) QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) |
| 哺乳动物组织 | QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) |
| 血液 | QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN) DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) |
| 昆虫 | DNeasy血液和组织抽提试剂盒 (QIAGEN) |
| 水生无脊椎动物 | 海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANGEN) |
| 植物 | TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit (TaKaRA)) DNeasy 96 Plant Kit (QIAGEN) 高效植物基因组DNA提取试剂盒 (TIANGEN) |
| 藻类 | 高效植物基因组DNA提取试剂盒 (TIANGEN) |
| 酵母 | DNeasy血液和组织抽提试剂盒 (QIAGEN) |
| 真菌 | DNeasy 96 Plant Kit (QIAGEN) |
| 细菌 | TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TaKaRa) 细菌基因组DNA提取试剂盒 (FOREGENE) |
微生物群落样品DNA提取试剂盒推荐
| 样品类型 | 推荐试剂盒 |
|---|---|
| 粪便 | QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN) PowerSoil DNA Extraction Kit (MoBio) FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) |
| 肠道内容物 | QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN) |
| 肠道黏膜 | FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) |
| 皮肤 | PureLink Genomic DNA Kit (Invitrogen) |
| 口腔 | QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) |
| 土壤 沉积物 活性污泥 | FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) Power Soil DNA Extraction Kit (MoBio) TIANamp Soil DNA Kit (TIANGEN) |
| 水体 | PowerWater DNA Isolation Kit (MoBio) 水体基因组DNA提取试剂盒 (FOREGENE) |
基本分子生物学实验系列
核酸提取
DNA提取
RNA提取
特殊DNA的提取
核酸质量检测
目的基因PCR和克隆
PCR技术的基本原理
引物设计和实验技巧
功能基因的克隆技术
荧光定量qPCR
荧光定量qPCR基本原理
绝对定量
相对定量
荧光定量qPCR的实验设计和体系优化
荧光定量qPCR仪器设置