基于扩增子测序的功能基因研究技术（三）——整合子基因盒

整合子

抗生素

1944年，链霉素的发现者Waksman给抗生素下的定义是，微生物在其代谢过程中产生的，具有抑制其它种类微生物生长及活动甚至杀死其它种类微生物的化学物质。

20世纪80年代，随着抗肿瘤和寄生虫等抗生素的不断发现，这类化合物的作用已经超出了仅仅对微生物的作用范围，因此，一般认为，抗生素的定义应该是，在低浓度下有选择地抑制或影响其它种类生物机能的，是微生物生命过程中产生的具有胜利活性的次级代谢产物计其衍生物。

抗生素抗性基因

由于抗生素的滥用，由抗生素抗性基因所引发的医疗和环境问题日趋严重。

抗生素抗性基因即微生物中存在的、其表达产物能够抵抗抗生素的基因。

抗生素抗性基因的作用机制可以分为4类：

• 依靠细胞膜阻止抗生素进入细胞；

• 外排泵将抗生素排出；

• 对抗生素的作用靶标进行突变；

• 修饰或降解抗生素。

人类对于抗生素的研究主要分为3个阶段：

• 早期认为抗生素是非常好的药品，可以治疗各种疾病；

• 在发现抗生素抗性之后，进入了抗生素健康风险的研究阶段；

• 在2000年左右，发现了可移动抗生素抗性基因，现在已经把抗生素抗性基因作为一种污染物质在研究。

水平基因转移

抗生素抗性基因最重要的威胁是其可以通过水平基因转移在不同微生物之间传播，从而能够使得原本不携带抗性基因的致病微生物具有抗生素抗性，进而抑制抗生素对疾病的治疗。

抗生素抗性基因的水平基因转移分为3种类型：

转化：环境中位于微生物外部的游离DNA直接被微生物吸收。

转导：外源DNA通过噬菌体的帮助在不同微生物之间进行传播。

结合转移：通过不同微生物表面的接触，在细胞膜表面打开一个通道，使得可以移动的基因单元在不同微生物之间进行传播，该机制是水平基因转移最主要的方式。

第一类整合子

在结合转移的过程中，涉及到多个DNA结构，并且通过不同DNA单元的相互关联完成基因转移的完整过程。

其中最基础的就是整合子，其负责基因的整合，之后将整合的基因通过插入序列将其从染色体转移到质粒上，最后质粒携带整合的基因在不同微生物之间进行转移。

因此，在水平基因转移的过程中，具体哪些基因能够进行转移实际上是由整合子确定的。

目前共发现了5类整合子，其中第一类整合子是研究最为透彻，也是最为常见的整合子。

第一类整合子是由两端的保守区域包裹中部的可变基因盒构成的。

在整合子的5’端为其整合酶基因，负责捕获和整合待转移的基因，其3’端包含3个保守的开放阅读框，分别为季胺类抗性基因qacE、磺胺类抗生素抗性基因sul1和未知功能基因。

在两端保守区域内部的部分称为基因盒，其通过attI和attC位点间隔多个基因，基因盒内基因的数目是不固定的，基因盒内的基因即为可在不同微生物间转移的基因。

基因盒内的基因大多为抗生素抗性基因，也有部分重金属抗性基因和其它功能基因，因此，第一类整合子的基因盒通常被用于研究抗生素抗性基因的转移能力。

技术流程

应用针对attI和attC位点的引物5’-CS:GGCATCCAAGCAGCAAG和3’-CS:AAGCAGACTTGACCTGA对DNA样品进行PCR扩增。

得到的PCR产物即为第一类整合子内部基因盒所含有的基因序列。

对扩增得到的PCR产物作为DNA模板进行常规宏基因组测序和分析，即可得到样本中可转移基因的信息，从而评估哪些抗生素抗性基因能够发生水平基因转移，进而评估抗生素抗性基因的人类健康风险。

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