Cell：新型冠状病毒感染可被蛋白酶抑制剂阻断
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一项最新的研究发现，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）利用SARS-CoV受体ACE2进入细胞，并利用丝氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白，其感染可被一种已经过临床验证的蛋白酶抑制剂阻断。该研究由德国灵长类动物研究中心、哥廷根大学生物和心理学系以及柏林卫生研究院病毒中心合作开展，于2020年2月27日在线发表在Cell Press细胞出版社旗下期刊Cell《细胞》上，题为“SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically-proven protease inhibitor”。该研究对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染机制提供了更深刻的见解，为正在肆虐的病毒感染提供了一种新的的治疗选择，亦为控制病毒的传播提供了启示。
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新型冠状病毒（SARS-CoV-2）近期的传播构成了全球卫生紧急情况。冠状病毒进入细胞依赖于病毒刺突蛋白（S）与细胞受体的结合，并通过宿主细胞蛋白酶激活S蛋白。阐明SARS-CoV-2利用哪些细胞因子进入细胞，有可能对防止病毒传播提供启示，揭示治疗靶标。
在此，本研究证明了SARS-CoV-2利用SARS-CoV受体ACE2进入细胞，利用丝氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白。作者发现一种批准用于临床的TMPRSS2抑制剂可阻止病毒进入细胞，为治疗提供了新的选择。最后，研究结果显示了来自恢复期SARS患者的血清可交叉中和SARS-2-S驱动的病毒进入。揭示了SARS-CoV-2和SARS-CoV感染之间的重要共性，并鉴定出一种抗病毒潜在靶标。
图1
此前的研究发现，冠状病毒的S蛋白有助于介导病毒进入宿主细胞。位于S蛋白表面的S1亚基与细胞受体的结合，帮助病毒附着至宿主细胞的表面。此外，来自于宿主细胞的蛋白酶在S1/S2和S2'位点切割并激活S蛋白。在S2亚基驱动下，病毒和宿主细胞发生膜融合（图1A）。SARS-S以血管紧张素转换酶2（ACE2）作为进入受体[1]，并利用细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2激活S蛋白[2][3][4]，SARS-S和SARS-2-S具有约76％的氨基酸序列相似性。但目前仍不清楚SARS-2-S是否也像SARS-S一样利用ACE2和TMPRSS2进入宿主细胞。
研究介绍
1. SARS-2-S在人源细胞内被有效水解
为了了解SARS-2-S如何进入细胞，并进一步为如何阻止该过程提供理论基础。作者首先检测了SARS-2-S是否可以在人源细胞系293T中稳定表达。由于某些冠状病毒S蛋白在S1/S2位点可以被宿主细胞的蛋白酶切割，继而验证SARS-2是否同样存在细胞内水解过程（图1A）。对表达具有C端抗原标签的SARS-2-S蛋白的293T细胞进行免疫印迹分析，发现一条与完整S蛋白（S0）分子量一致的条带（图1B）。在细胞中还能观察到一条具有S蛋白S2亚基预期分子量的条带（图1B），这种条带在带有SARS-2-S的水疱性口炎病毒（VSV）颗粒中能更显著地观察到。而在表达SARS-S的细胞和颗粒中，基本上不存在S2信号（图1B），这与先前的研究一致[2][5]。这些结果显示人细胞可以高效地水解加工SARS-2-S，这与SARS-2-S S1/S2剪切位点包含并不存在于SARS-S的数个精氨酸残基位点一致（图1A）。与之不同的是，SARS-2-S和SARS-S的S2’剪切位点比较相似。
2. SARS-2-S和SARS-S介导病毒进入相似的细胞系
此前的研究发现，承载冠状病毒S蛋白的复制缺陷型VSV颗粒可以忠实的反应冠状病毒进入宿主细胞的关键方面[6]。作者采用承载SARS-2-S的VSV假型病毒来研究SARS-CoV-2的入胞。SARS-2-S和SARS-S都可以高效的整合进VSV颗粒（图1B），这使得可以对两者一起进行比较，尽管S1亚基的整合还需要进一步证明。作者首先利用一系列已经过透彻鉴定的人源或动物源细胞系来分析SARS-2-S的易侵入细胞系。承载泛嗜性病毒糖蛋白的VSV颗粒符合预期得可以侵入所有细胞系（图1C和图S1）。SARS-S可以介导VSV颗粒侵入大部分人源细胞系和动物源的Vero和MDCKII细胞系（图1C）。此外，与SARS-S相比，SARS-2-S可以介导进入相同的细胞系（图1C），表明两者入胞受体选择上的相似性。
3. SARS-CoV-2利用SARS-CoV受体进入宿主细胞
为了阐明为什么SARS-S和SARS-2-S介导病毒进入相同的细胞系，作者接下来研究了SARS-2-S是否包含与ACE2（SARS-S进入受体）相互作用所需的氨基酸残基。
序列分析显示，SARS-CoV-2与蝙蝠的SARS-CoV相关病毒（SARSr-CoV）聚簇，其中一些（但非全部）可以利用ACE2进入宿主细胞。分析受体结合基序（RBM），即与ACE2接触的受体结合域（RBD）的一部分[7]，作者发现大多数SARS-S结合ACE2所必需的氨基酸残基在SARS-2-S中均保守。相比之下，以前发现的不使用ACE2进入的SARSr-CoV的S蛋白则几乎没有这些残基[8][9][10]。
图2
与这些发现相符的是，在原本不易感的BHK-21细胞中表达人源或蝙蝠来源的ACE2可以使SARS-2-S以及SARS-S病毒进入该细胞系（图2A），而表达人源DPP4（MERS-CoV使用的细胞进入受体）[11]或人源APN（HCoV- 229E使用的细胞进入受体）[12]却不能介导SARS-2-S或SARS的进入。并且，针对人ACE2的抗血清能够阻断SARS-S和SARS-2-S，而非VSV-G-或MERS-S驱动的细胞进入（图2B）。最后，被转染ACE2质粒的BHK-21细胞可高效感染SARS-CoV-2病毒（图2C），这表明SARS-2-S与SARS-S一样，利用ACE2作为进入细胞的受体。
4. 细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2通过激活SARS-2-S介导SARS-CoV-2病毒进入细胞，丝氨酸蛋白酶抑制剂可阻断病毒感染肺细胞
接下来，作者检测了SARS-CoV-2进入细胞的蛋白酶依赖性。此前的研究发现，SARS-CoV可以利用宿主细胞核内的半胱氨酸蛋白酶——组织蛋白酶B和L（CatB / L）[13]和丝氨酸蛋白酶TMPRSS2[2][3][4]在细胞系中激活S蛋白。若要强烈阻断病毒进入宿主，必须同时抑制两种蛋白酶[14]。但只有TMPRSS2的活性对于病毒在感染宿主中的传播和发病必不可少，而CatB / L的活性则可有可无[15-18]。
为了确定SARS-CoV-2是否可以使用CatB / L进入细胞，作者先使用氯化铵作为阻断剂进行了研究。氯化铵能提高内体pH值，从而阻断CatB / L的活性。作者对293T细胞（TMPRSS2-，转染ACE2）和Caco-2细胞（TMPRSS2+）进行进一步研究。
结果显示，氯化铵阻断了VSV-G介导进入两种细胞系，而由Nipah病毒F和G蛋白介导入胞过程则不受影响，这与Nipah病毒能与宿主细胞膜融合质膜而VSV不能的研究结果保持一致[19]。氯化铵处理强烈抑制了SARS-2-S和SARS-S介导进入TMPRSS2- 293T细胞的过程，表明二者都具有CatB / L依赖性。与293T细胞相比，抑制进入TMPRSS2 + Caco-2细胞的效率则较低，这符合SARS-CoV-2在Caco-2细胞中通过TMPRSS2激活SARS-2-S的推断。
图3
另一种经过临床验证的阻断剂——丝氨酸蛋白酶抑制剂卡莫司他具有抗TMPRSS2的活性[14]。在实验中，它可部分阻断SARS-2-S介导进入Caco-2和Vero-TMPRSS2细胞的过程。当同时施加卡莫司他和Cat-B / L抑制剂E-64d时，可达到完全阻断的效果（图3A），表明SARS-2-S可以同时使用CatB / L和TMPRSS2在这些细胞系中激活。相比之下，卡莫司他不会干扰SARS-2-S介导进入TMPRSS2- 293T和Vero细胞系的过程（图3A），后者可被E-64d有效地阻断因此是CatB / L依赖的。更进一步地，在细胞中表达TMPRSS2可以抵消E-64d对于SARS-2-S介导入胞过程的抑制作用（图3B），这证实了SARS-2-S可利用TMPRSS2激活S蛋白。
接下来，作者们分析了SARS-CoV-2肺细胞感染是否需要TMPRSS2。卡莫司他显著降低了MERS-S、SARS-S和SARS-2-S介导进入肺细胞系Calu-3的过程，但没有影响VSV-G介导入胞（图3C），且未产生细胞毒性。类似地，卡莫司他处理则能够显著降低SARS-CoV-2对Calu-3的感染（图3D）。最后，卡莫司他处理抑制了SARS-S和SARS-2-S介导进入人原代肺细胞的过程，而不抑制VSV-G介导入胞（图3E）。
综上，SARS-CoV-2可利用MPRSS2激活S蛋白，而TMPRSS2的抑制剂卡莫司他则可阻止SARS-CoV-2感染肺细胞。
6. SARS-CoV抗体可交叉中和SARS-CoV-2
图4
恢复期的SARS患者表现出针对病毒S蛋白的中和抗体应答[20]。作者调查了此类抗体是否能够阻断SARS-2-S驱动的细胞进入。结果显示，从三名康复期SARS患者中获得的四份血清以浓度依赖性方式抑制SARS-S而非VSV-G驱动的进入（图4）。此外，这些血清还减少了SARS-2-S介导入胞的过程，尽管与SARS-S相比效率较低（图4）。类似地，针对SARS-S的S1亚基产生的兔血清高效地降低了SARS-S和SARS-2-S介导入胞的过程，并且对抑制SARS-S更有效。因此，在感染或疫苗接种期间针对SARS-S产生的抗体反应可能会在一定程度上提供针对SARS-CoV-2感染的保护。
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本文参考文献（上下划动查看）
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