新宠！细胞谱系研究中的CRISPR-Cas9工具鼠 | Cell Press 青促会述评

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作为世界领先的全科学领域学术出版社，细胞出版社特与“中国科学院青年创新促进会”合作开设“青促会述评”专栏，以期增进学术互动，促进国际交流。

第六期专栏文章，由来自中国科学院广州生物医药与健康研究院副研究员、中国科学院青年创新促进会会员 王可品，就 Cell 中的论文发表述评。

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体内细胞谱系示踪是研究特定细胞在发育、再生和疾病过程中所起作用的有效研究方法。传统的体内细胞谱系示踪技术主要依赖于重组酶系统，例如Cre-loxP重组酶系统(Sauer and Henderson, 1988)。但通过使用重组酶介导的荧光标记仅可识别和跟踪小群体细胞。另外，重组酶系统在追踪单个细胞时也具有局限性，限制了对细胞群的异质性研究。

CRISPR-Cas9系统可对基因组进行精准切割，在不存在同源修复序列的情况下，可通过非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）的方式进行修复，导致在切割位点随机引入短序列的插入和删除（insertions and deletions, indels）。这些indels可在细胞中稳定遗传，可作为区分细胞的条形码。目前，基于CRISPR/Cas9系统介导的细胞条形码技术已应用到细胞谱系示踪研究中。使用该技术进行谱系示踪研究首次在斑马鱼胚胎中实现(McKenna et al., 2016)，结合单细胞测序技术，该技术可以在单细胞水平获得基因表达数据并进行谱系示踪研究(Alemany et al., 2018; Raj et al., 2018; Spanjaard et al., 2018)。最近，将表达的标签通过转座子整合到小鼠胚胎内，该技术也应用到小鼠细胞的谱系示踪(Chan et al., 2019; Kalhor et al., 2018)。上述应用都是用组成型表达的Cas9和多条形码来获得indels的多样性。其不足在于：每次都需要通过胚胎操作获取小鼠模型，而且由于随机插入的转基因数量较多，因此产生的小鼠无法稳定繁殖。因此，这些模型不适用于成体组织的谱系分析。

为了解决上述问题，在最新一期的Cell文章中，Fernando D. Camargo领导的研究团队，通过利用一种CRISPR-Cas9工具鼠，被称为CRISPR array repair lineage tracing (CARLIN) 小鼠品系，可在任意成体阶段实现可诱导的单细胞水平谱系示踪和基因表达谱分析。

该CARLIN小鼠品系在Rosa26位点插入增强型的反向四环素反式激活因子（M2-rtTA），M2-rtTA受内源性Rosa26启动子启动；在Col1a1基因的一个等位位点插入四环素反应性元件（TetO）和Cas9表达框（tetO-Cas9）；在Col1a1另外一个等位位点插入10条sgRNA表达框及EGFP和靶序列表达框，每条sgRNA受独立U6启动子启动，EGFP和靶序列同时受外源CAG启动子控制；靶序列包括10个sgRNA靶向位点，每个靶向位点包括13bp保守序列、7bp可变序列、3bp PAM区和4bp连接区。因此，在Dox不存在时，M2-rtTA不能与TetO结合，Cas9基因不表达，sgRNA不起作用，靶位点不被修饰；而当Dox存在时，M2-rtTA能与TetO结合，进而使得Cas9表达，sgRNA起作用，靶位点被修饰，修饰的靶位点可作为特异的谱系示踪标签(图1)。作者首先在CARLIN胚胎干细胞上验证了靶位点分子标签的多样性与Dox孵育时间及浓度有关，并证实该技术可以在胚胎干细胞增殖过程中进行谱系示踪并重构系统发育树。

▲图1  CARLIN小鼠品系设计原理图

随后，作者通过喂食CARLIN小鼠7天Dox，收取各组织进行RNA-Seq分析，结果显示，CARLIN靶位点在各个组织（除脑、心脏和骨骼肌）的编辑效率为31%-88%，而没有喂食DOX小鼠基本检测不到编辑效果（约1%）。对编辑的标签多样性分析结果显示，每只喂食Dox的CARLIN小鼠88%的编辑方式 (约6,485–11,921种) 是特有的，表明产生的绝大部分的标签是独特的，可以用来谱系示踪研究。作者也通过模拟计算的方式，估计出CARLIN小鼠可产生44,000 ± 400种独特的编辑方式，足够进行详尽的体内细胞谱系示踪。

接着，作者在CARLIN小鼠胚胎期（6.5天、9.5天和13.5天）添加Dox，8周龄时取各组织进行RNA-Seq并对各组织标签进行分析，结果表明可进行多层次的体内细胞谱系重建。结合单细胞RNA-Seq技术，作者在9.5天CARLIN小鼠胚胎添加Dox，标记最开始出现的血液前体细胞，8周龄时取骨髓，流式分选c-Kit阳性细胞进行单细胞RNA-Seq（图2），通过优化实验程序，32%–63%的测序细胞可检测到CARLIN位点，这些细胞可分离出36个独特的细胞群，对这些细胞群进行CARLIN标签分析，鉴定出46个独特的细胞克隆，这些细胞克隆含有1-123个不同类型细胞，另外，通过分析单细胞转录组确定了这些细胞的谱系关系。最后，通过分析单细胞测序和CARLIN标签数据，作者研究了5-FU损伤后造血再生过程中细胞克隆动态变化关系。

▲图2 利用CARLIN小鼠品系进行血液前体细胞谱系示踪示意图

总结全文，作者构建了一种可用于谱系示踪的CRISPR-Cas9工具鼠模型，该模型具有可诱导、可转录、可稳定表达的特点，可同时在单细胞水平进行谱系示踪和表达谱分析（图3）。该小鼠模型的应用可直接扩展到其他实体器官特定细胞的谱系示踪研究，为研究特定细胞在发育、再生和疾病过程中的作用提供强有力的工具。

▲图3  全文总结

本文参考文献（上下划动查看）

1 Alemany, A., Florescu, M., Baron, C.S., Peterson-Maduro, J., and van Oudenaarden, A. (2018). Whole-organism clone tracing using single-cell sequencing. Nature 556, 108-+.

2 Chan, M.M., Smith, Z.D., Grosswendt, S., Kretzmer, H., Norman, T.M., Adamson, B., Jost, M., Quinn, J.J., Yang, D., Jones, M.G., et al. (2019). Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature 570, 77-+.

3 Kalhor, R., Kalhor, K., Mejia, L., Leeper, K., Graveline, A., Mali, P., and Church, G.M. (2018). Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science 361, 893-+.

4 McKenna, A., Findlay, G.M., Gagnon, J.A., Horwitz, M.S., Schier, A.F., and Shendure, J. (2016). Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science 353, 11.

5 Raj, B., Wagner, D.E., McKenna, A., Pandey, S., Klein, A.M., Shendure, J., Gagnon, J.A., and Schier, A.F. (2018). Simultaneous single-cell profiling of lineages and cell types in the vertebrate brain. Nat Biotechnol 36, 442-+.

6 Sauer, B., and Henderson, N. (1988). SITE-SPECIFIC DNA RECOMBINATION IN MAMMALIAN-CELLS BY THE CRE RECOMBINASE OF BACTERIOPHAGE-P1. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5166-5170.

7 Spanjaard, B., Hu, B., Mitic, N., Olivares-Chauvet, P., Janjuha, S., Ninov, N., and Junker, J.P. (2018). Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR-Cas9-induced genetic scars. Nat Biotechnol 36, 469-+.

论文摘要

细胞谱系示踪是回答生物学中各种基本问题的关键。细胞祖先信息与其它分子信息的结合是该领域的的一个重要目标。在本研究中，我们构建了CRISPR阵列修复谱系示踪(CARLIN)小鼠品系，并提供了相应的分析工具，可以用来同时在体内进行单细胞水平的谱系示踪和转录组学研究。该模型利用CRISPR技术，可在发育或成年的任何阶段诱导产生最多44,000个转录的条形码，具有连续条形码编辑和稳定遗传到子代细胞的特点。我们使用CARLIN小鼠识别胎儿肝脏造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)克隆活动的内在偏差，并发现以前未发现的造血干细胞对损伤反应的克隆瓶颈。CARLIN系统还可以在不进行细胞分选的情况下对与HSC动态变化相关转录特征进行无偏差识别。

Tracing the lineage history of cells is key to answering diverse and fundamental questions in biology. Coupling of cell ancestry information with other molecular readouts represents an important goal in the field. Here, we describe the CRISPR array repair lineage tracing (CARLIN) mouse line and corresponding analysis tools that can be used to simultaneously interrogate the lineage and transcriptomic information of single cells in vivo. This model exploits CRISPR technology to generate up to 44,000 transcribed barcodes in an inducible fashion at any point during development or adulthood, is compatible with sequential barcoding, and is fully genetically defined. We have used CARLIN to identify intrinsic biases in the activity of fetal liver hematopoietic stem cell (HSC) clones and to uncover a previously unappreciated clonal bottleneck in the response of HSCs to injury. CARLIN also allows the unbiased identification of transcriptional signatures associated with HSC activity without cell sorting.

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评述人简介

王可品

中国科学院青促会会员

中科院广州生物医药与健康研究院副研究员

王可品，博士，中国科学院青年创新促进会会员，中国科学院广州生物医药与健康研究院副研究员，主要从事基因修饰大动物模型的构建及应用研究，目前已构建20多种基因修饰克隆猪模型。以第一作者或通讯作者（含共同）在Nature Communications,Genome Research,Stem Cell Reports,Journal of Molecular Cell Biology,Cellular and Molecular Life Sciences等杂志发表论文5篇。主持国家自然科学基金“人类疾病大动物模型构建”专项项目1项，青年基金项目1项、广州市科技项目1项等多项。

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相关论文信息

原文刊载于CellPress细胞出版社旗下期刊Cell上，

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