“以子之矛，攻子之盾”：中科院王四宝团队研发出利用昆虫miRNA提高生防真菌杀虫效力的新方法 | Cell Press对话科学家
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近日，中国科学院分子植物科学卓越创新中心王四宝研究员团队提出“以子之矛，攻子之盾”的策略，研发出一种提高生防真菌杀虫效力的新方法：利用寄主昆虫自身的miRNA遗传改造生防菌来削弱害虫免疫反应，从而增强生防真菌的杀虫效力。2022年10月25日，该研究成果以“Expression of mosquito miRNAs in entomopathogenic fungus induces pathogen-mediated host RNA interference and increases fungal efficacy”为题，发表在Cell Press细胞出版社Cell Reports期刊上。该方法实现了利用多靶点、无选择压力、安全的效应因子miRNA对生防菌的遗传改良，在增强生防菌杀虫效力和解决蚊虫抗药性的难题方面具有巨大的应用潜力和价值。
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昆虫通过取食作物或吸血给农业生产和人类健康造成严重危害。蚊虫是疟疾、登革热、黄热病、寨卡等多种疾病的传播媒介，对人类身体健康和世界公共卫生安全构成了严重威胁。目前，蚊虫的防治主要依赖化学杀虫剂，但是化学农药的长期使用导致蚊虫产生抗药性，迫切需要研发新的绿色替代工具来安全有效地防治蚊虫。球孢白僵菌是一种环境友好的生防真菌，能够通过体表直接侵染杀死昆虫，对防治刺吸式口器的蚊虫具有独特的优势，是一种环境友好型的微生物杀虫剂。由于昆虫在与病原菌长期攻防和博弈的过程中进化出高效的免疫防御系统对抗真菌的侵染，导致生防真菌的杀虫速率比较缓慢，制约了真菌杀虫剂的广泛应用。菌株遗传改良是提高生防菌杀虫效力的有效手段，例如通过高表达外源毒素或毒力蛋白增强生防真菌的杀虫毒力，但是效应蛋白作用靶标单一，还会导致靶标昆虫产生选择性压力。因此，亟待研发多靶点、无选择压力、安全的效应因子用于生防菌的遗传改良。
Small RNA（sRNA, 主要包括miRNA和siRNA）介导的RNA干扰（RNA interference, RNAi）是真核生物中高度保守干扰基因转录后表达的重要调控机制。miRNA在昆虫响应病原菌侵染的免疫调控中发挥重要作用。王四宝团队前期研究发现，sRNA能够在昆虫与病原真菌间进行双向传递，参与昆虫免疫和病原真菌致病性的调控，这种突破物种界限，跨物种转运到寄主或微生体细胞内干扰靶基因表达的现象，称为跨界RNA干扰（Cross-kingdom RNAi）。
本研究中，王四宝研究团队提出“以子之矛，攻子之盾”的策略，首次研发出一种利用寄主miRNAs遗传改造生防菌，跨界干扰害虫基因的表达来提高生防菌杀虫效力的新方法（pathogen-mediated RNAi，pmRNAi）。用pmRNAi方法成功构建表达寄主昆虫miRNA的工程白僵菌不仅对杀虫剂敏感蚊虫的杀虫效率有显著提高，对多种杀虫剂抗性的野生埃及伊蚊同样有很好的防治效果，有望解决蚊虫抗药性的难题。本研究为增强生防菌杀虫效能提供了新思路，为研发安全高效的真菌等微生物杀虫剂开辟了新方向，为蚊虫和其它害虫的绿色防控提供了新工具。
中国科学院分子植物科学卓越创新中心博士后崔春来和2021级博士生王燕（已毕业）为论文的共同第一作者，博士研究生李祎斐、孙佩璐和云南省寄生虫病防治所周红宁主任技师和姜进勇副主任医师参与了该项目研究，王四宝研究员和上海科技大学刘竞男副研究员为论文的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、国家重点研发计划和中国博士后科学基金等项目的资助。
图1. 利用病原菌介导的RNAi (pathogen-mediated RNAi，pmRNAi)提高生防真菌杀虫效力
亮点
研发出一种利用寄主昆虫自身的miRNA改造生防真菌增强杀虫效力的新方法。
工程菌株能够将其表达的miRNA跨界转运到寄主昆虫细胞内有效干扰寄主免疫基因的表达。
表达昆虫miRNA的工程菌株对野生抗药性蚊虫表现出增强的防治效果，有助于解决蚊虫抗药性难题。
作者专访
Cell Press细胞出版社公众号特别邀请王四宝研究员代表研究团队接受了专访，请他为大家进一步详细解读。
CellPress：
您是如何想到利用寄主来源的sRNA改良生防真菌提高杀虫毒力的呢？研究过程中的难点有哪些？
王四宝教授：
该研究工作是在我们多年的研究基础上开展的，前期工作中我们发现了sRNA可以在蚊虫与病原真菌间进行双向传递，参与跨界调控蚊虫免疫和病原真菌的致病性。这种sRNA的双向跨界传递表现在：蚊虫可以将自身的miRNA传递到病原真菌细胞来跨界抑制致病基因的表达，抑制真菌感染【1】；同样，病原真菌也可以将其诱导表达的sRNA跨界转运到感染蚊虫细胞内干扰免疫基因的表达【2】。这些前期研究提示我们或许可以利用sRNA在病原菌与昆虫互作过程中跨界调控的功能，使其成为高效的效应因子应用于生防真菌的遗传改良。基于此，我们提出了“以子之矛，攻子之盾”的策略，利用昆虫自身的负向调节免疫的miRNA作为效应因子，通过遗传工程，构建高效表达寄主miRNA的工程菌株，当工程菌侵染昆虫时高表达的sRNA使昆虫丧失对抗真菌的免疫反应，达到高效杀虫的效果。当工程菌侵染害虫时，将表达的miRNA跨界转运到感染昆虫的细胞内干扰免疫基因的表达，达到抑制免疫、提高真菌杀虫效力的效果。研究难点在于首先要筛选鉴定出高效的免疫抑制性miRNA，并成功构建出高表达寄主miRNA的工程菌株。
CellPress：
请问利用寄主miRNA改造生防真菌增强防治效果的生物学机制是什么？
王四宝教授：
研究中我们筛选鉴定出负调控蚊虫Toll免疫通路的两个miRNA，即miR-8和miR-375，这些miRNAs能够从真菌细胞跨界转运到感染的蚊虫细胞内，分别靶向沉默蚊虫Toll免疫信号通路受体Toll5B和转录因子Rel1A的转录表达，同时还激活Toll通路抑制因子Cactus的转录表达，从而抑制蚊虫抗菌肽基因的表达，显著下调蚊虫抗菌肽基因的表达，降低蚊虫抗真菌的免疫反应，加快感染蚊虫的死亡速度，从而增强真菌的杀虫效果。
CellPress：
利用寄主miRNA改造生防真菌的pmRNAi新方法具有哪些优势？
王四宝教授：
病原菌介导的RNAi（pathogen-mediated RNAi，pmRNAi）新方法具有以下优点：1）与靶标单一的杀虫毒蛋白相比，miRNA具有多靶标特性，单个miRNA可以在一个或多个途径中靶向多个基因来发挥其生物学功能，此外，单个靶基因也可受到多个miRNAs的组合调控；2）理论上，一个菌株中可表达多个寄主miRNAs，实现对害虫免疫或其他生理过程的重要靶基因或通路进行操纵，进一步提高真菌杀虫剂的防效，使得该方法在生防菌的遗传改良上具有巨大的应用潜力；3）某些昆虫来源的miRNAs具有种属特异性，可通过定制害虫特异的miRNA提高工程菌的寄主靶向性和特异性；4）使用寄主来源的miRNA进行菌株改良可以避免害虫产生选择压力，因为昆虫对自身免疫和生理健康至关重要的内源性miRNA不易产生选择抗性；5）相比于外源毒素或毒蛋白基因，使用害虫自身的miRNA可以消除公众对于工程菌株生物安全性的担忧。pmRNAi方法实现了利用多靶点、无选择压力、安全的效应因子对生防菌的遗传改良，利用丰富的寄主miRNAs改造生防菌，为研发安全高效的真菌等生物杀虫剂开辟了新方向和新思路。
CellPress：
请问pmRNAi方法对防治抗性蚊虫是否有效？
王四宝教授：
野生蚊虫对氯菊酯、氯氰菊酯等各类化学杀虫剂产生了不同程度的抗药性，严重影响蚊虫防治效果。为验证蚊虫免疫抑制性miRNAs改造的白僵菌是否对抗性蚊虫有防治效果，我们对具有多种杀虫剂抗药性的野生埃及伊蚊品系进行了毒力测试，发现表达miR-8或miR-375的工程菌株比野生型菌株表现出更强的杀虫效果，缩短半数致死时间（LT50）达30%左右。利用miRNA改造生防真菌不仅对杀虫剂敏感蚊虫的杀虫效率有显著提高，对多种农药抗性的野生蚊虫同样有很好的杀虫效果，还对其它农业害虫有作用，使得该方法在生防菌的遗传改良和农药抗性蚊虫的防治上展现出巨大的应用潜力。
CellPress：
请问您接下来的研究重点是什么？
王四宝教授：
未来我们将继续深入开展miRNA介导调控蚊虫等害虫与病原菌互作的研究，揭示不同的miRNAs调控害虫-病原体互作的分子机理和调控网络，为基因工程改造生防菌提供“武器弹药”。另外，我们将选取调控害虫不同免疫途径、代谢等生理重要过程的miRNAs进行组合表达，进一步增加生防菌的杀虫效力；并使用感染时期特异和诱导型的启动子驱动表达miRNAs，以时空特异性的表达方式增强生防菌的防治效果。
作者介绍
王四宝
研究员
论文通讯作者，王四宝，中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所二级研究员、博士生导师，中国科学院昆虫发育与进化生物学重点实验室主任，入选中国科学院首批特聘核心岗位，国家科技创新领军人才、授予国家有突出贡献中青年专家称号。主要从事媒介昆虫-病原体-肠道微生物互作的分子机理及防控新策略的研究，近年取得了一系列具有国际影响的创新成果：揭示了疟蚊集群婚飞的分子机制和雌雄求偶的化学通讯奥秘，阐明了肠道微生物介导调控蚊虫与病原物互作的分子机制，发展了基于媒介肠道共生菌的疟疾传播阻断控制新策略，开辟了源头阻断蚊媒疾病传播的新途径和新方法；揭示了蚊虫与病原真菌互作的表观遗传调控机制，研发出一种利用跨界RNAi提高生防菌杀虫效力的“以子之予，攻子之盾”的新方法等。近5年研究成果以通讯作者分别发表在Science (2017, 2021), Nature Microbiology (2021), Science Advances (2020), Nature Communications (2019), PNAS (2017, 2021), Cell Reports（2022）等国际主流学术期刊。担任上海市昆虫学会理事长、中国菌物学会副秘书长、常务理事，中国菌物学会青年工作委员会主任，中国昆虫学会昆虫微生物组学专业委员会副主任，中国昆虫学会昆虫比较免疫与互作专业委员会副主任等。
崔春来
博士后
论文第一作者，崔春来，中国科学院分子植物科学卓越创新中心博士后，2020年毕业于中国科学院大学，同年进入中国科学院分子植物科学卓越创新中心进行博士后研究，主要致力于蚊虫与病原体互作的分子机制研究，以第一作者或共同一作在Nature Communications、PNAS、Cell Reports、Trends in Parasitology等国际主流学术期刊发表多篇论文，曾荣获国家自然科学基金青年项目、中国博士后科学基金面上项目（资助一等）、上海市“超级博士后”等多个项目资助。
王燕
博士
论文第一作者，王燕，2021年博士毕业于中国科学院分子植物科学卓越创新中心，博士期间主要研究miRNA跨界调控昆虫-病原真菌互作的分子机理，以第一作者或共同一作在PNAS、Nature Communications、Cell Reports等国际主流期刊发表多篇论文，曾获得朱李月华优秀博士生奖学金、荃银创新人才奖学金、中国科学院优秀毕业生、北京市优秀毕业生等荣誉。
相关论文信息
▌论文标题：
Expression of mosquito miRNAs in entomopathogenic fungus induces pathogen-mediated host RNA interference and increases fungal efficacy
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(22)01383-3
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111527
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